INOKULASI VIRUS dan UJI HA-HI

INOKULASI VIRUS PADA TELUR AYAM BEREMBRIO, UJI PRESIPITASI AGAR, SERTA UJI HA-HI CEPAT DAN UJI HA-HI LAMBAT

I. TUJUAN

a. Inokulasi virus pada telur berembrio

Mengetahui cara menginokulasi virus pada telur ayam berembrio dan cara pemanenannya.

b. Uji Presipitasi Agar (UPA)

1. Mengetahui interaksi antara antigen dan antibodi virus ND ayam secara kualitatif.

2. Menentukan jenis virus berdasarkan antigen.

c. Hemaglutination (HA) dan Hemaglutination Inhibition (HI) Test

1. Mengetahui ada tidaknya pertumbuhan virus ND dengan memakai uji HA dan HI cepat.

2. Mengetahui ada tidaknya pertumbuhan virus ND dengan memakai uji HA dan HI lambat.

3. Mengidentifikasi virus yang menghambat aglutinasi dengan uji HI cepat.

4. Mengukur titer antibodi terhadap virus ND dengan uji HI lambat.

5. Uji hemaglutinasi dengan pelat mikro untuk mengetahui titer enceran virus yang terkecil yang masih mampu mengaglutinasi eritrosit ayam dan hambatan aglutinasi dengan pelat mikro berguna untuk mengetahui titer pengenceran terkecil antibodi pada serum ayam yang masih mampu menghambat aglutinasi virus tertentu.

II. TINJAUAN PUSTAKA

Virus adalah penyebab infeksi terkecil berdiameter 20-300 nm. Genom virus hanya mengandung satu macam asam nukleat yaitu RNA/DNA. Asam nukleat virus terbungkus dalam suatu kulit protein yang dapat dikelilingi oleh selaput yang mengandung lemak. Seluruh unit infektif disebut virion. Virus hanya bereplikasi dalam sel hidup. Replikasinya dapat intranuklear atau intrasitoplasmik (Jawetz, 1996).

Diluar sel hidup partikel virus tidak dapat melakukan metabolisme, itu merupakan masa transisi dari virus. Fase transmisi diluar sel ini diselingi oleh fase reproduksi dalam sel, ketika itu virus terdiri atas gen virus aktif yang dengan menggunakan metabolisme inangnya menghasilkan genom turunan dan protein virus untuk dirakit menjadi virion baru (Fenner, 1993).

VIRUS DAN PROTEIN VIRUS

Virus merupakan mikroorganisme uniseluler dengan diameter 20–300 nm mengandung satu jenis asam nukleat RNA atau DNA sebagai genomnya. Partikel virus lebih kecil daripada bakteri, virus tidak tumbuh pada media buatan.Virus hanya melakukan multiplikasi dalam sel hidup. Virus tidak membelah secara binner.

Satu partikel virus yang komplek disebut virion. Protein yang ineksius yang ditemukan ada hewan dan manusia disebut prion. Siklus hidup virus ada 2 macam yaitu :

1. Fase intraseluler : fase ketika melakukan kegiatan (reproduktif)

2. Fase ekstraseluler : fase ketika tidak melakukan kegiatan (transmisi / inaktif)

Di luar sel hidup partikel virus tidak dapat melakukan metabolisme, fase ini disebut dengan fase transmisi dari virus. Fase transmisi diluar sel ini diselingi oleh fase reproduksi dalam sel, ketika itu virus terdiri dari gen virus aktif yang dengan menggunakan sistem metabolisme inangnya menghasilkan genom turunan dan protein virus untuk dirakit menjadi virioun baru. Viral atau virus replikasi terjadi di dalam sitoplasma dan di dalam nukleus, adapun fase – fase dari reproduksi atau replikasi virus adalah attachment, penetration, uncoating, transcription of early mRNA, translation of early protein, replication of viral DNA, transcription of late mRNA, translation of late protein, assembly of virion dan akhirnya release.

Protein Virus

Beberapa protein tersandi-virus merupakan protein struktur yaitu merupakan bagian dari virion.Peran dari protein struktur adalah memberi lapisan perlindungan terhadap asam nukleat . Termasuk ligan yang berfungsi untuk perlekatan pada sel hospes. Ada 2 macam protein virus, yaitu :

1. Protein structural

Terdiri dari Capsomer yang menyusun kapsid dan glikoprotein pada amplop virus.

2. Protein non-struktural

Berkaitan dengan virion dan merupakan enzim yang sebagian besar terlibat dalam transkripsi,regulasi dan replikasi. Contohnya enzim polymerase ketika berada dalam sel hospes. Dan contoh lainnya adalah transcriptase yang mentranskripsi mRNA dari genom virus ds DNA atau ds RNA atau dari genom virus dengan ssRNA polaritas minus.

VIRUS NEW CASTLE DISEASE (Paramyxovirus unggas I )

Newcastle disease virus

Virus classification

Group: Group V ((-)ssRNA) Order: Mononegavirales Family: Paramyxoviridae Genus: Avulavirus Species: Newcastle disease virus

(http://en.wikipedia.org/wiki/Newcastle_disease)

http://en.wikipedia.org/wiki/Image:Newcastle_disease_in_a_mallard.JPG

Famili Paramyxoviridae mempunyai 3 genus, Paramyxovirus, Morbilivirus, dan Pneumovirus. Genus yang menyebabkan kerugian ekonomis paling besar adalah Newcastle Disease virus, Rinderpest virus dan Bovine Respiratory Syncitium Virus. Paramyxovirus memiliki nukleokapsid bagian dalam yang berukuran 18 nm. Nukleokapsid dan hemaglutinin dibentuk dalam sitoplasma. Genom virus bersifat linear, RNA rantai tunggal (single strainded RNA) dengan berat molekul (BM) 5-7 x 10⁶, tidak bersegmen, dan virionnya polimorfik (Jawetz, 1996).

Newcastle Disease virus merupakan anggota pertama dari genus Paramyxovirus (PMV) yang diisolasi dari unggas pada tahun 1926. Virus yang tergolong genus Paramyxovirus dapat dibedakan dari virus lainnya oleh karena adanya aktifitas neuraminidase yang tidak dimiliki oleh virus lain pada famili Paramyxoviridae. Virus ND mempunyai aktifitas biologik yaitu kemampuan untuk mengaglutinasi dan menghemolisis sel darah merah atau fusi dengan sel-sel tertentu, mempunyai kemampuan neuraminidase dan kemampuan untuk bereplikasi di dalam sel-sel tertentu (Fenner,1993)

Tetelo merupakan penyakit ayam yang sangat merugikan, pertama kali ditemukan oleh Kraneveld di Jakarta (1926). Setahun kemudian, virus tetelo ditemukan juga di Newcastle (Inggris). Sejak saat itu, penyakit ini dikenal sebagai newcastle disease (ND) dan ditemukan di berbagai penjuru dunia. Di India, penyakit ini dikenal dengan nama aanikhet. Virus ND termasuk dalam genus Rubulavirus, famili Paramyxoviridae. Tidak semua virus ND yang ditemukan bersifat ganas. Beberapa di antaranya hanya bersifat ringan, bahkan dapat dimanfaatkan sebagai bibit vaksin untuk mencegah penyakit ND yang ganas. Mengingat virus ND ada yang ringan dan ganas, ditentukan empat kelompok keganasan virus ND :

a. Infeksi virus velogenik-viserotropik(vvND)

Menimbulkan penyakit akut dengan kematian tinggi

b. ND - Neurotropic Velogenic

Akut dan fatal pada ayam di berbagai umur disertai gejala syaraf dan respirasi, dan terdapat adanya lesi pada usus.

c. Virus Mesogenik

Menyebabkan kematian akut dengan kematian moderat disertai gejala pernafasan dan syaraf

d. Virus Lentogenik

Bertanggung jawab terhadap infeksi pernafasan ringan

(www.thepoultrysite.com/diseaseinfo/111/newcas... dan Pedoman Penyakit Unggas)

Untuk mengetahui keganasan virus ND dapat dilakukan dengan cara menghitung waktu kematian rata-rata (mean death time) pada telur berembrio yang ditulari dengan virus ND.

(www.poultryindonesia.com)

Gambar struktur virus ND

http://www.fao.org/DOCREP/005/AC802E/ac802e0o.htm

Berdasarkan atas kesamaan antigenik pada uji Hemaglutinasi Inhibisi (HI), maka dikenal 9 serotipe Avian Paramyxovirus, yaitu Paramyxovirus tipe 1 (PMV-1) sampai PMV-9. Diantara 9 serotipe tersebut maka virus ND termasuk dalam PMV-1 yang merupakan virus yang terpenting pada unggas. Avian Paramyxovirus tipe-2 (PMV-2) dapat ditemukan pada burung, termasuk burung peliharaan dan jarang pada ayam atau kalkun. Avian Paramyxovirus tipe-3 (PMV-3) dapat ditemukan pada burung peliharaan dan kalkun di kanada, USA, UK, Perancis dan Jerman. Berdasarkan atas virulensinya, maka virus ND dapat dibedakan menjadi galur velogenik, mesogenik dan lentogenik. Pembagian tersebut berdasarkan atas waktu kematian embrio setelah disuntik oleh virus ND tertentu melalui selaput alantois. Waktu kematian embrio untuk galur velogenik adalah kurang dari 60 jam, galur mesogenik sekitar 60-90 jam dan galur limtogenik lebih dari 90 jam. Berbagai galur virus ND tersebut dipakai untuk menyatakan virus yang sangat virulen, moderat virulen dan kurang virulen. Berdasarkan dari gejala klinis yang timbul pada ayam, maka ND dapat dibagi atas 5 bentuk, yaitu Doyle, Beach, Beaudette, Hitchner dan Enterik asimptomatik :

1. Bentuk Doyle tersifat adanya gangguan pencernaan akibat pendarahan dan nekrosisi pada saluran pencernaan sehingga dikenal dengan ND velogenik-viserotropik.

2. Bentuk Beach tersifat oleh adanya gejala gangguan pernafasan dan saraf sehingga disebut ND velogenik-neurotropik.

3. Bentuk Beaudette merupakan bentuk ND velogenik-neurotropik yang kurang patogenik dan biasanya kematian hanya ditemukan pada ayam muda. Virus ND penyebab infeksi pada bentuk ini tergolong tipe patologik lentogenik dan dapat dipakai sebagai vaksin aktif untuk vaksinasi ulangan terhadap ND.

4. Bentuk Hitchner di tandai oleh adanya infeksi pernafasan yang ringan atau tidak tampak, yang di timbulkan oleh virus dengan tipe patologik lentogenik, biasanya juga untuk vaksin aktif.

5. Bentuk enterik asimtomatik terutama merupakan infeksi pada usus yang ditimbulkan oleh virus ND tipe lentogenok dan tidak menimbulkan suatu gejala penyakit tertentu.

Morfologi virus ND

Virus ini terdiri dari single molecule dari single strand RNA dengan berat molekul 5 x 10⁶ dalton, urutan dari sequencing nucleotida NDV adalah terdiri dari 15.156 nukleotida, partikel virus terdiri dari kira – kira 20–25 % lipid dan 6 % karbohidrat yang diperoleh dari sel hospesnya dan berat keseluruhan partikel virus tersebut adalah 500 x 10⁶ dalton dengan densitas di dalam sukrosa adalah 1,18 – 1,20 g/ml. Morfology dari paramyxovirus adalah partikel virus berbentuk pleomorfik secara umum berbentuk melingkar dengan diameter 100 – 500 nm meskipun apabila dilihat kadang tampak adanya filamen yang melintang dengan panjang 100 nm, permukaan dari virus diselubungi dengan projection dengan panjang kira – kira 8 nm.

Dibandingkan dengan kebanyakan paramyxovirus virus penyakit Newcastle relatif lebih tahan panas, sifat yang sangat penting berkaitan dengan epidemiologi dan pengendaliannya. Virus ini tetap menular pada sumsum tulang dan otot dari ayam yang disembelih paling tidak selama 6 bulan pada temperatur – 20 ⁰ C dan sampai 4 bulan pada temperatur almari pendingin. Virus yang menular dapat bertahan hidup sampai berbulan – bulan pada temperatur kamar pada telur dari ayam yang terinfeksi dan sampai lebih dari satu tahun pada temperatur 4 ⁰ C. Daya tahan hidup yang demikian itu dapat diamati untuk virus pada bulu dan virus dapat tetap menular untuk jangka waktu yang lama pada kandang terinfeksi, senyawa yang dapat digunakan untuk desinfeksi adalah seperempat bagian amonium, lisol 1- 2 %, kresol 0,1 %, dan formalin 2 %. ( Fenner, 1993)

Newcastle Disease Virus (Credit: Immunologisches Onkologisches Zentrum Köln www.ioz-cologne.de)

(www.brandeis.edu/.../applicationsNewcastle.html)

TABEL. 1. Fungsi dan terminologi dari protein virus pada Paramyxovirus.

Fungsi	Genus
	Paramyxovirus	Morbillivirus	Pneumovirus
Pelekatan protein; Hemaglutinin, perangsangan imunitas produktif.	HN	H	G (tidak ada aktifitas heaglutinasi)
Neuraminidase, perlekatan virion, perusakan penghambatan mucin.	HN	None	None
Protein penggabung; penggabumgan sel, penyusupan virus, penyebaran sel ke sel, membantu perangsangan imunitas perlindungan.	F	F	F
Nukleoprotein; perlindungan terhadap RNA genom.	NP	N	N
Transkriptase; transkripsi genom RNA.	L dan P	L dan P	L dan P
Protein matriks; kestabilan inti virion.	M	M	M
Lain-lain; fungsi yang tidak diketahui.	SH	-	SH, 22K

(Fenner, 1993)

Virus ND dapat diidentifikasi dengan melihat morfologinya menggunakan mikroskop elektron atau dengan uji serologis. Uji serologis yang dapat dipakai antara lain Hemaglutinasi (HA), Hemaglutination Inhibition (HI), Netralisasi virus dalam embrio ayam, netralisasi virus dalam kultur sel, MIT test, Egg bit, ELISA, Agar Gel Presipitasi (AGP). Sedangkan antigen virus dapat dilacak dengan teknik Immunohistokimia dan Immunofluorescence (Stephen, 1980).

Protein-protein dalamVirus ND

Virus ND sangat patogen dan V protein merupakan salah satu protein yang menentukan virulensi virus sementara itu hemagglutinin-neuraminidase (HN) protein merupakan protein yang memegang peranan penting dalam proses infeksi. Hampir semua spesies unggas peka terhadap infeksi ND, tetapi ayam adalah spesies yang paling peka. Laporan tentang kasus penyakit ND pada ayam dan penelitian penyakit ini sudah banyak dilakukan.

Adapun penyusun dari komponen polypeptida virus ND adalah HN (hemaglutininn dan neuraminidase) yang bertanggung jawab pada proses hemaglutinin dan neuraminidase, F atau fusion protein, NP atau nucleocapsid protein, P atau phosphorylated, dan M atau matriks, pada kultur sel virus ini menunjukkan adanya cytopathic effect yaitu adanya formasi dari synsitium dan sekelompok sel yang mengalami kematian.

Virus newcastle atau paramyxovirus unggas I adalah salah satu virus family paramyxoviridae dengan genus paramyxovirus yang menyebabkan terjadinya penyakit dengan gejala pada sistem saraf pusat yang menyerang pada unggas yang di piara secara liar maupun intensif. Penyakit yang ditimbulkan disebut dengan tetelo disease atau newcastle disease dengan sinonim yang lain yaitu antara lain pseudofowl pest, pseudovogel pest, atypische geflugel pest, pseudopoultry plague, avian pest dan sampar ayam.

Gejala Klinis virus ND

Gejala klinis yang ditimbulkan oleh virus New Castle Disease adalah masa inkubasi pada infeksi alami adalah 4 – 6 hari, keragaman dalam virulensi menentukan kelangsungan penyakitnya. Penyakit perakut yang berkaitan dengan galur virus velogenik biasanya mematikan. Penyakit akut dan sub akut yang berkaitan dengan galur virus mesogenik dan lentogenik paling umum ditemukan di negara maju dengan industri perunggasan modern. Penyakit dimulai dengan anoreksia, meningkatnya temperatur tubuh sampai 43 ⁰ C (normal 40 – 41 ⁰ C), kelesuan, kehausan, disertai bulu kusam, jengger berdarah, mata tertutup, dan larings serta farings yang kering. Unggas yang sakit akan bersin – bersin dan menderita gangguan pernapasan, serta mencret berair. Penurunan produksi telur dapat berlangsung sampai 8 minggu. Telur yang dikeluarkan selama fase ini kecil dan kulitnya lunak, dan albuminnya berair. Unggas yang sembuh memperlihatkan tanda kerusakan sistem saraf pusat, dicirikan dengan paralisis kaki, ataksia, tortikalis, dan pergerakan berputar – putar, atau oleh myokloni dan tremor. Pada kalkun gejala klinisnya mirip dengan ayam sedangkan pada burung ekor panjang, itik, dan angsa gangguan sistem saraf pusat yang pertamakali dapat diamati. Pada merpati terjadi penyakit ganas yang menyebar dengan cepat ditandai dengan anoreksia, mencret, poliuria, konjungtivitis, busung, gangguan sistem saraf pusat yang meliputi paresis kaki dan sayap.

Newcastle Disease affects the respiratory, nervous, and digestive systems. One of the clinical signs of the disease is swelling of the tissues around the eyes and the neck as shown in this photo. (Credit: U.S. Department of Agriculture)

(www.brandeis.edu/.../applicationsNewcastle.html)

(www.urbanwildlifesociety.org/WLR/PMV-RH&H-WWW.htm)

Figure 28. Severe haemorrhagic and necrotic lesions in proventriculus and Peyers patches in the intestines of a broiler chicken suffering from one of the severe forms of Newcastle disease (viscerotropic velogenic).

Patogenesis dan immunitas

Patogenesis dan imunitas dari virus New Castle Disease adalah pada mulanya virus bereplikasi pada epitel mukosa dari pembuluhan pernapasan bagian atas dan pembuluhan pencernaan, segera setelah terinfeksi virus menyebar lewat aliran darah ke ginjal dan sumsum tulang yang menyebabkan viremia sekunder, inilah yang menyebabkan viremia sekunder yang menimbulkan infeksi pada organ sasaran yaitu paru – paru, usus, dan sistem saraf pusat. Kesulitan bernafas dan sesak napas timbul akibat penyumbatan pada paru – paru dan kerusakan pada pusat pernapasan di otak. Perubahan pasca mati meliputi perdarahan echimose pada laryngs, trakea, oesofagus dan di sepanjang usus. Lesi histologi yang paling menonjol adalah nekrosis terpusat pada mukosa usus dan jaringan limfe dan perubahan hiperemia di sebagian besar organ termasuk otak.

Hemaglutination Test (Uji HA) dan Hemaglutination Inhibition Test (Uji HI)

Beberapa virus tertentu mampu mengaglutinasi eritrosit. Kemampuan ini sebagai contoh dari aktivitas biologik dan aktivitas ini dapat dihambat oleh antibodi tertentu. Sisi partikel virus yang spesifik dapat berinteraksi dengan reseptor mukoprotein pada sel darah merah dan permukaan sel lain. Interaksi dari sisi reseptor dan virion membuat aglutinasi sel darah merah menjadi tampak. Enzim virus neuraminidase memecah ikatan antara virus dan sel, dan melepas keduanya ke dalam larutan. Antigen adalah bagian virus yang mengandung ikatan dan antigen dari virus digunakan untuk uji hemaglutinasi (Merchant and Packer, 1956)

Virion dari beberapa keluarga virus berikatan dengan sel darah merah (RBC) dan menyebabkan hemaglutinasi. Prinsip serologis dari hemaglutinasi inhibisi yaitu antibodi menghambat proses hemaglutinasi dari virus. Bila antibodi spesifik dan virus dicampur sebelum ditambah eritrosit, hemaglutinasi akan terhambat. Uji penghambatan hemaglutinasi ternyata sensitif kecuali untuk Togavirus, sangat spesifik, karena uji itu mengukur antibodi yang berikatan pada protein permukaan yang paling gampang mengalami perubahan antigenik. Terlebih lagi, uji ini sederhana, murah, dan cepat. Oleh karena itu, sering digunakan sebagai pilihan prosedur serologis dalam mengidentifikasi isolat dari virus yang menyebabkan hemaglutinasi (Fennner, 1993).

Virus-virus Avian dapat mengaglutinasi eritrosit, termasuk didalamnya NDV (Newcastle Disease Virus), Virus influenza dan virus Adenovirus127. Hambatan dari aglutinasi oleh antibodi spesifik merupakan dasar dari uji HA dan HI cepat pada kaca benda. Uji HA dan HI cepat pada kaca benda merupakan uji yang sesuai dan cepat dilakukan yang penerapannya lebih luas untuk kontrol berbagai penyakit Avian seperti Newcastle Disease maupun Micoplasmosis. Uji HA positif akan menunjukkan adanya suspensi agregat eritrosit yang berkeping-keping. HI cepat pada kaca benda menunjukkan positif apabila tidak terlihat aglutinasi pada cairan korioalantois yang diberi antiserum NDV. Uji HA cepat biasanya dipakai untuk mengidentifikasi virus yang mampu menghemaglutinasi eritrosit ayam. Sedang uji HI cepat biasanya dipakai untuk identifikasi NDV. Uji HA lambat digunakan untuk mengetahui titer virus, kemampuan virus dalam menginfeksi yang ditandai dengan adanya hemaglutinasi eritrosit. Titer virus dapat diketahui dengan melihat sumuran terakhir pada nomor tertinggi (end point) yang menunjukkan adanya hemaglutinasi positif. Hal itu ditandai dengan adanya agregat-agregat di dasar sumuran (Stephen, 1980).

Prinsip dari uji HI lambat adalah mengetahui adanya antibodi yang mampu menghambat proses hemaglutinasi oleh virus. Uji ini untuk menentukan titik antibodi terhadap hemaglutinasi NDV. Bila terdapat antibodi dalam jumlah mencukupi untuk membentuk kompleks dengan virion, hemaglutinasi dihambat, dan eritrosit mengendap. Sebaliknya bila antibodi terdapat dalam jumlah yang tidak mencukupi maka eritrosit diaglutinasi oleh virus dan membentuk endapan (Allan, 1978).

Hemaglutinasi oleh virus ND dapat dihitung dan di bawah kondisi standar dalam cairan dapat di lihat. Reaksi HA dapat di hambat oleh serum immune yang spesifik. Beberapa strain virus ND dapat ditunjukkan virulensinya dalam aktivitas HA dengan eritrosit mammalia dan dalam panas yang stabil. Antigen yang tidak signifikan tidak dapat dilaporkan (Aloisi, 1979).

HI test (uji hemaglutinasi inhibisi) telah menjadi metode yang tepat dalam mendeteksi kehadiran antibodi spesifik dalam serum yang terinfeksi atau dari individu yang sembuh/ pulih dari sakit. Selanjutnya, dengan mendilusi (diencerkan) serum, jumlah komparatif dari antibodi dapat ditentukan. (Merchant, Ival Arthur, )

Faktor-faktor yan berhubungan dengan terjadinya proses non-spesific hemaglutinasi :

1. Kontaminasi kimia dari tabung atau bahan. Misalnya asam.

2. Substansi inhibitor dalam ekstrak jaringan.

3. Keanehan dari sel darah merah dari individu tertentu.

4. Komponen serum yang labil terhadap panas

5. Enzim dan toksin bakteri

6. Ketidaksesuaian spesies antara sel darah merah yang digunakan dan serum yang diuji.

(Merchant, )

Uji Presipitasi Agar (UPA) atau Agar Gel Precipitation Test (AGPT)

Tujuan dilakukannya UPA adalah untuk mengetahui adanya antigen virus dan antibodi tubuh. Prinsip dari uji UPA yaitu adanya ikatan antibodi spesifik dengan antigen yang ditandai dengan adanya garis presipitat. Hal ini disebabkan karena antigen virus berdifusi melalui pori-pori purified semisolid agar dan bereaksi dengan antibodi. Presipitasi antigen oleh antibodi dapat pula terjadi pada medium semisolid yang biasa dipakai yaitu pure agar dari Euchemia spinosum. Uji ini dapat disebut juga dengan Double Immunodifusion Test atau Ouchterlowy´s Double Difusion yang menempatkan antigen antibodi pada agar murni yang terpisah dalam cawan petri. Dapat ditemukan bahwa antigen-antibodi (Ag-Ab) menyebar ke dalam agar murni. Dan pada awal pembentukan pita presipitasi disebabkan karena adanya keseimbangan rasio antara Ag-Ab. Jika terjadi kelebihan antigen, maka pita presipitasi yang terbentuk akan bergerak mendekati sumuran antibodi. Meskipun terjadi difusi yang radial dari sumuran, pita presipitasi tampak seperti lengkungan diantara sumuran Ag-Ab. Faktor-faktor yang dapat mempengaruhi kondisi pertumbuhan virus adalah :

o pH

Dapat terjadi presipitasi jika media berada pada pH 7,0-7,2, sedangkan pada pH 5,0-5,5 tidak menyebabkan terjadinya presipitasi.

o Konsentrasi antigen dan antibodi

Adanya konsentrasi antibodi yang sesuai dengan konsentrasi antigen dapat menyebabkan terjadinya presipitasi atau immunodifusi di luar sumuran.

o Suhu

Temperatur inkubasi pada reaksi aglutinasi bervariasi, kurang lebih 50-560 C. Sedangkan pada yang lain pada suhu 270 C.

o Kelembaban

Media agar tidak disimpan dalam lemari es karena agar akan menjadi kering, pada temperature panas media menjadi cair. Sehingga tempat penyimpanan dibuat menyerupai lembah dengan nampan yang diberi kapas dan air.

o Media agar

Media yang digunakan adalah media agar semisolid, dapat juga dipakai agar gelatin/ silika. Yang paling umum digunakan adalah agar-agar. Agar-agar menjadi larut atau cair bila dipanaskan pada suhu hampir 1000 C dan tetap berbentuk cair bila didinginkan hingga kurang lebih 430 C. Pada gelatin, jika telah padat dan dipanaskan 1000 C untuk mencairkan kembali. Tidak dianjurkan membiarkan medium agar menjadi padat lalu mencairkannya kembali lebih dari 2 kali karena dapat memberikan hasil yang kurang baik.

o Jarak sumuran

Jika jarak terlalu jauh atau tidak sama antara kiri dan kanan dapat mengakibatkan tidak terbentuknya presipitat.

o Lama inkubasi

Pembentukan ikatan antibodi-antibodi membutuhkan waktu sekitar 2-3 hari. Jadi jika kurang dari waktu yang ditentukan kemungkinan presipitat belum terbentuk.

Interpretasi dari garis presipitat antara lain :

© Dapat teridentifikasi

Jika ikatan antibodi dengan antigen yang sama determinannya pada tiap antigen sampel atau bisa juga dikatakan dua antigen tersebut identik sehingga mereka akan berdifusi dengan kecepatan yang sama dan daerah proporsi optimal akan terdapat pada lokasi yang sama.

© Identifikasi parsial

Jika terjadi reaksi silang, yaitu dua antigen dapat serupa dan memiliki determinan bersama, sehingga menghasilkan pembentukan pita berbentuk tapal kuda.

© Tidak teridentifikasi

Tidak teridentifikasi terhadap antibodi terpilih sehingga tidak terjadi garis presipitasi yaitu dengan difusi antigen atau antibodi lebih lanjut, pembentukan kompleks solubel akan terjadi, tetapi penyatuan akan dipertahankan, karena pita-pita terus terbentuk dan larut dengan kecepatan yang sama. Jika sebaliknya dua antigen tersebut berbeda sama sekali, pita-pita akan bersilang.

Inokulasi Virus

1. In Ovo

Metode ini merupakan penanaman virus pada telur ayam yang berembrio.

Metode ini dapat dilakukan dengan berbagai cara antara lain:

r Inokulasi pada ruang chorioalantois

Biasanya digunakan embrio ayam dengan umur 10-12 hari. Jarum dimasukkan ¾ inci dengan sudut 45º dan diinjeksikan 0,1-0,2 ml virus yang akan diinokulasikan. Setelah 40-48 jam cairan telur yang sudah diinkubasi dapat diuji untuk hemaglutinasi dengan membuat lubang kecil pada kerabang di pinggir dari rongga udara. Dengan alat semprot yang steril dan jarumnya, diambil 0,1-0,2 ml cairannya. Campur 0,5 cairan telur dengan perbandingan yang sama dari 10% suspensi dari sel darah yang di cuci bersih dalam plate. Putar plate dan lihat aglutinasi setelah 1 menit. Cairan alantois yang terinfeksi dipanen setelah 1-4 hari inokulasi. Untuk mencegah darah dalam cairan, embrio disimpan semalam dalam suhu 4ºC kemudian injeksi kerabang dekat rongga udara dan buka kerabang tersebut dengan pinset steril. Membran ditekan ke atas yolk sac dan cairan diambil dengan spuit dan dimasukkan ke dalam cawan petri. Kultur cairan tersebut untuk menghindari cairan terkontaminasi bakteri (Stephen,1980).

Contoh virus yang diinokulasikan pada ruang chorioalantois ini antara lain, virus ND dan virus influenza.

r Inokulasi pada membran chorioalantois

Inokulasi pada embrio umur 10-11 hari adalah yang paling cocok. Telur diletakkan horizontal di atas tempat telur. Desinfektan kerabang disekitar ruang udara dan daerah lain di atas embrio telur. Buat lubang pada daerah tersebut dan diperdalam lagi hingga mencari membran kerabang. Virus diinokulasikan pada membran korioalantois dan lubang ditutup dengan lilin dan diinkubasi. Setelah 3-6 hari korioalantois membran yang terinfeksi dapat di panen dengan mengeluarkan yolk sac dan embrio secara hati-hati tanpa membuat membran lepas dari kerabang. Area inokulasi dapat di lihat dengan adanya lesi pada CAM sebelum dilepas dari kerabang (Stephen, 1980).

r Inokulasi pada yolk sac

Inokulasi dilakukan pada embrio umur 5-7 hari. Post inokulasi diinkubasi selama 3-10 hari. Virus diinokulasikan pada bagian yolk sack dan dijaga jangan sampai terkontaminasi bakteri (Stephen, 1980).

Virus yang biasa diinokulasikan di bagian ini adalah virus rabies.

2. In Vitro

Inokulasi virus dengan metode ini dilakukan dengan menanam virus pada kultur jaringan. Kultur jaringan virus dimulai dengan kultivasi embrio anak ayam cincang didalam serum atau larutan-larutan garam. Ini menuntun ke arah penggunaan kultur jaringan murni sel-sel hewan yang dapat ditumbuhi virus. Kini sel hewan dapat ditumbuhkan dengan cara yang serupa seperti yang digunakan untuk sel bakteri. Bila sel-sel hewan dikulturkan di wadah-wadah plastik atau kaca, maka sel-sel tersebut akan melekatkan dirinya pada permukan wadah itu dan terus-menerus membelah diri sampai seluruh daerah permukaan yang tertutupi medium terisi. Terbentuklah suatu lapisan tunggal sel dan dipergunakan untuk mengembangkan virus. Sel-sel jaringan yang berbeda-beda lebih efektif untuk kultivasi beberapa virus ketimbang yang lain. Pendekatan ini telah memungkinkan kultivasi banyak virus sebagai biakan murni dalam jumlah besar untuk penelitian dan untuk produksi vaksin secara komersial. Juga luas penggunaannya untuk isolasi dan perbanyakan virus dari bahan klinis. Vaksin yang disiapkan dari kultur jaringan mempunyai keuntungan dibandingkan dengan yang disiapkan dari telur ayam berembrio dalam hal mengurangi kemungkinan seorang pasien untuk mengembangkan hipersensitivitas atau alergi terhadap albumin telur (Merchant and Packer, 1956).

3. In Vivo

Dengan cara ini, virus dapat ditanam pada hewan laboratorium yang peka. Metode ini merupakan metode yang pertama kali dalam menanam virus. Metode ini dapat digunakan untuk membedakan virus yang dapat menimbulkan lesi yang hampir mirip misalnya FMDP atau Vesikular Stomatitis pada sapi. Hewan laboratorium yang digunakan antara lain mencit, tikus putih, kelinci ataupun marmut (Merchant and Packer, 1956).

INOKULASI DAN PANEN PADA TELUR AYAM BEREMBRIO

Pengamatan Telur Melalui Transiluminasi (Peneropongan)

Embrio telur dipastikan hidup dengan cara transiluminasi yang diberi istilah candling dalam bahasa Inggris karena pada zaman dahulu cahaya lilin digunakan untuk tujuan ini. Pada masa ini, yang digunakan ialah kotak cahaya atau lampu teropong yang telah dimodifikasi.

Tata cara Peneropongan Telur

Bahan :

1. Telur berembrio

2. Lampu teropong

3. Kertas manila

4. Pita seloptip

5. Gunting

6. Pena penanda

Alat untuk peneropongan :

Gulungkan selembar kertas manila supaya berbentuk kon. Gunakan pita seloptip untuk melekatkannya dan mengekalkan bentuk ini. Gunting kedua ujung kon ini supaya tepinya menjadi sama rata dan garis pusat bagian yang lebih besar adalah sama dengan ukuran kepala lampu dan bagian kecil adalah lebih kurang sama dengan ukuran ujung telur yang lebih bulat. Pasangkan ujung kon yang besar kepada kepala lampu teropong. Perkuat dengan menambahkan pita seloptip. Dengan ini cahaya lampu akan ditujukan ke luar melalui lubang yang lebih kecil.

Cara Kerja :

1. Pilih tempat yang gelap.

2. Tekan lubang terowong lampu teropong kepada cangkang telur.

3. Nyalakan lampu dan amatilah bagian dalam telur.

4. Pastikan pembuluh darah korioalantoik telur berembrio kelihatan jelas sekali dan embrio bergerak-gerak, bentuk embrio juga jelas kelihatan, khususnya mata embrio yang besar dan kehadiran ruang udara. Semua ini adalah tanda yang menunjukkan bahwa embrio tersebut masih hidup.

Inokulasi Virus ke dalam Ruang Alantoik

Pertumbuhan virus di dalam membran alantoik digunakan untuk virus influenza dan paramiksovirus yang telah disesuaikan beraplikasi dalam keadaan makmal.

Cara Kerja Inokulasi Virus ke dalam Ruang Alantoik

Bahan :

1. Telur berembrio berumur 10 hingga 12 hari.

2. Jarum (28 gauge) dan picagari.

3. Etanol 70% dan iodium tinctur.

4. Penggerudi berputar yang dipasang dengan cakera pemotong.

5. Pita seloptip.

Cara Kerja

1. Teropong telur untuk menentukan embrio masih hidup.

2. Tandakan dengan pena tanda satu tempat yang agak berjauhan dengan pembuluh darah.

3. Gerudi satu lubang atau celah yang kecil pada cangkang pada tempat yang ditandakan untuk mendedahkan membran cangkang.

4. Lap tempat celah tersebut dengan etanol.

5. Suntikkan 0.1 ml inokulum ke dalam celah ini dengan jarum yang dimasukkan beberapa mm ke dalam celah.

6. Tutup celah dengan pita seloptip.

7. Eramkan dengan tempat yang diinokulasi virus di sebelah atas selama 1 hingga 3 hari sesuai kebutuhan.

Cara Kerja Mengumpulkan Cairan Alantoik (Panen virus)

Bahan :

1. Telur berembrio selepas penyuntikan virus dan pengeraman

2. Gunting

3. Pipet Pasteur

4. Botol (steril)

5. Etanol 70%

Cara Kerja :

1. Letakkan telur di dalam *)almari es selama beberapa jam atau di dalam peti beku suhu –20°C selama 1 jam.

2. Lap cangkang di bagian atas ruang udara telur dengan etanol.

3. Pecahkan cangkang di atas ruang udara dan guntingkan satu lubang besar.

4. Gunakan pipet Pasteur untuk menolak embrio dan pundi kuning telur ke tepi dan kumpulkan Cairan alantoik dengan menggunakan pipet Pasteur lain.

Keterangan :

*) Telur dimasukkan almari es untuk membunuh embrio serta mengecilkan pembuluh darah supaya pengumpulan cairan yang mengandung virus dilakukan tanpa pencemaran dengan sel darah merah.

Selain cara di atas masih terdapat metode lain tempat-tempat inokulasi virus, yaitu :

1. Inokulasi Virus ke atas Membran Korioalantoik

Pengkulturan virus di atas membran korioalantoik untuk membedakan antara poksvirus jenis variola dengan vaksinia dan di antara virus herpes simplex tipe 1 dengan tipe 2 berdasarkan morfologi poks yang dihasilkan. Contoh virusnya adalah poxvirus,vaccinia, virus penyebab ILT

2. Inokulasi Virus ke dalam Ruang Amniotik

Cara ini digunakan untuk pemencilan primer (kali pertama virus ditumbuh dalam keadaan makmal) virus influenza dan mumps.

3. Inokulasi virus dalam Embrio

Penanaman virus yang diletakkan pada bagian emrio dari TAB. Contoh virusnya adalah influenza

4. Inokulasi virus secara intracerebral

5. Inokulasi virus secara intravena

6. Inokulasi virus kuning telur (yolk sack)

Penanaman virus pada bagian kuning telur / yolk sack dari TAB. Contohnya rabies,distemper dll.

Perkembangan Virus Dalam Telur Berembrio

Telur ayam berembrio telah lama merupakan sistem yang telah digunakan secara luas untuk isolasi, perkembangan dan karaterisasi avian virus serta untuk memproduksi vaksin virus. Embrio dan membran pendukungnya menyediakan keragaman tipe sel yang dibutuhkan untuk kultur berbagai tipe virus yang berbeda. Keberhasilan dalam mengisolasi dan mengembangkan virus tergantung pada beberapa kondisi yaitu : rute inokulasi, umur embrio, temperatur inkubasi, waktu inkubasi setelah inokulasi, volume dan pengenceran dari inokulum yang digunakan, status imun dari kelompok dimana telur ayam berada. Telur sebaiknya berasal dari kelompok yang bebas dari patogen spesifik (spesific pathogen free flock) atau jika tidak mungkin dapat menggunakan telur dari kelompok bebas antibodi ND Virus. Penggunaan telur dari kelompok antibodi positif akan mengurangi kemampuan virus untuk tumbuh dan berhasilnya isolasi virus. Sejalan dengan banyaknya sistem untuk isolai virus, dibutuhkan cara untuk mendeteksi infeksi virus. Bukti tidak langsung dari infeksi virus pada embrio ayam dapat diketahui dari satu atau lebih kejadian berikut yaitu : kematian embrio, pembentukan lesi pada CAM seperti edema atau perkembang plak, lesi pada embrio seperti kekerdilan, hemoragi cutaneus, perkembangan otot dan buku yang abnormal, abnormalitas pada organ visceral termasuk pembesaran hepar dan lien, perubahan warna kehijauan pada kaki, foci nekrotik pada hepar. Metode yang langsung dan pasti untuk infeksi virus pada embrio ayam meliputi : kemampuan cairan corioallantois dan untuk menyebabkan hemaglutinasi dari RBC ayam, penggunaan teknik serologis dan molekular, mikroskop elektron. Harus diperhatikan untuk dapat membedakan lesi yang mungkin disebabkan oleh adanya bakteri dan agen lain (Purchase, 1989).

Struktur Telur Berembrio

Membran kulit telur yang fibrinous terdapat di bawah kerabang. Membran membatasi seluruh permukaan dalam telur dan membentuk rongga udara pada sisi tumpul telur. Membran kulit telur bersama dengan cangkan telur membantu mempertahankan intregitas mikrobiologi dari telur, sementara terjadinya difusi gas kedalam dan keluar telur. Distribusi gas di dalam telur dibantu dengan pembentukan CAM yang sangat vaskuler yang berfungsi sebagai organ respirasi embrio. Pembentukan membran ini terjadi berdekatan dengan membran telur sepanjang telur. Selama pembentukan, membran membentuk ruangan yang relatif besar disebut kantong allantois yang mengandung 5-10 ml cairan allantoic. Embrio secara langsung dikelilingi oleh membran amnion yang membentuk kantong amnion yang berisi 1-2 ml cairan amnion. Embrio melekat pada kantong kuning telur yang berlokasi kira-kira ditengah telur dan menyuplai kebutuhan nutrisi untuk perkembangan embrio (Purchase, 1989).

Gambar: Struktur telur berembrio (EnchantedLearning.com)

Rute inokulasi

Empat rute yang paling umum untuk inokulasi pada telur berembrio melalui :

- Ruang allantois.

- Chorio Alantois membran (CAM)

- Kantong kuning telur

- Kantong amnion.

(Purchase, 1989)

(EnchantedLearning.com)

Gambar: Skema perkembangan telur ayam berumur 5, 10, 15 dan 20 hari

ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)

Dapat digunakan secara kualitatif maupun kuantitatif dalam mengukur antigen dan antibodi binding. Berdasarkan variasi yang digunakan, ELISA akan mendeteksi antigen (hormon, enzim, antigen dari mikrobia, dll) atau antibodi (contoh anti-HIV pada screening test untuk infeksi HIV) pada cairan tubuh atau supernatan dari kultur jaringan.

Dibutuhkan untuk ELISA

• Antigen purified (murni), jika digunakan untuk mendeteksi atau mengukur antibodi.
• Antibodi purified (murni), jika digunakan untuk mendeteksi atau mengukur antigen.
• Larutan standar (kontrol positif dan kontrol negatif)
• Sampel yang diuji
• Microtiter dishes : terbuat dari plastik dengan sumuran kecil
• Buffer
• Enzim yang melabeli antibodi dan substrat enzim
• ELISA reader (spektrofotometer) untuk menghitungan kuantitatif

Prosedur

Untuk mendeteksi antibodi (indirect ELISA)

• Lapisi microtiter plate dengan antigen purified dengan cara memberikan larutan antigen pada wells/sumuran selama 30 – 60 menit. Bersihkan antigen yang tidak terbatasi, dengan menggunakan buffer dan ditutup dengan nonspesifik antibodi yang proteinnya tidak berkaitan , kemudian cuci lagi dengan unbound protein.
• Tambahkan serum sampel yang akan diuji untuk antibodi spesifik ke plate and membiarkan antibodi spesifik untuk mengikat antigen. Bagian Fc dari anti-Ig akan berikatan dengan enzim. Bersihkan unbound antibodi-antigen komplek.
• Tambahkan substrat chromogenic : substrat yang tidak berwarna yang akan diubah enzim menjadi produk yang berwarna. Inkubasi hingga terbentuk warna, ukur warna pada spektrofotometer. Semakin banyak warna yang terdeteksi, antibodi yang lebih spesifik dapat diketahui pada sampel yang tidak diketahui.
• Kontrol negatif meliputi : antigen yang hilang dan test antiserum yang hilang atau subtitusi dengan antibodi yang tidak akan mengikat antigen.
• Kontrol positif subtitusi yang diiketahui serum positif untuk serum yang tidak diketahui.

http://microvet.arizona.edu/Courses/MIC419/ToolBox/elisa.html

Mendeteksi antigen (sandwich ELISA)

• Lapisi microtiter dengan antibodi purified untuk antigen. Cuci unbound antibodi dan tutup dengan hambatan nonspesifik dengan protein yang tidak berkaitan.
• Tambahkan sampel untuk diuji antigen ke plate dan biarkan antigen mengikat antibodi. Cuci unbound antigen.
• Tambahkan enzim yang sudah terlabeli spesifik antibodi untuk epitope yang berbeda dari antigen untuk membuat “sandwich”, bersihkan unbound antibodi.
• Tambahkan substrat chromogenic untuk enzim yang dapat mengubah ke produk yang berwarna
• Kontrol negatif yaitu antigen yang tidak diketahui menghilang. Kontrol positif digunakan untuk mengetahui antigen

http://microvet.arizona.edu/Courses/MIC419/ToolBox/elisa.html

Mengintepretasikan hasil dengan cara menghitung produk yang terwarnai adalah proporsional untuk menghitung enzym-linked antibodi yang terikat, dimana secara langsung berkaitan dengan jumlah antibodi yang ada pada antigen yang terikat atau antigen yang ada pada antibodi terikat. Jika jumlah antigen or antibodi ditambahkan, kurva standar yang dibuat akan memperbolehkan antigen atau antibodi yang tidak diketahui menjadi terhitung.

http://www.elisaassay.com/competition-elisa-assay/

CELL CULTURE

Interaksi antara virus dan hospes akan menunjukkan dua level ; pertama kemampuan dari virus untuk mencapai sel dan kedua adalah interaksi antara virus dan genome hospes untuk mengontrol sintesis pada sel. Interaksi antara virus dan hospes secara luas dapat dihitung dengan genetik constitution cell dan konsentrasi virus.

Primary Cell Lines

• Sel line didapat secara langsung dari hewan

Ambil dari jaringan dalam bagian kecil dan diinkubasi dengan protease untuk merusak ikatan antar sel.

Untuk memisahkan sel dengan gunting, pipet , mengumpulkan sel, dan sentrifuse

Tempatkan sel pada media penumbuh jaringan yang ditambahkan dengan serum .

• Kultur primer cenderung memiliki bentuk sel yang normal
• Memiliki batas hidup yang terbatas.

Secondary Cell Lines

• Populasi sel yang tidak dapat mati
• Dapat meningkat secara spontan (pada rhodensia) atau dapat bertransformasi dengan tumor, virus, carcinogen atau mutagen
• Komponen pertumbuhan berbeda dengan sel dari apa yang dihasilkan.

Interaksi antara virus dan hospes

Keberadaan dari reseptor yang spesifik pada sel hospes akan membiarkan virus untuk mengikat, meskipun interaksi spesifik antara virus dan sel hospes dapat mengakibatkan hasil infeksi yang berbeda-beda

PCR (Polymerase Chain Reaction)

Merupakan teknik yang secara luas digunakan pada biologi molekular. PCR digunakan untuk menjelaskan bagian spesifik dari DNA target. Kebanyakan metode PCR menjelaskan DNA fragmen hingga 10kb, walaupun beberapa teknik memperbolehkan amplifikasi fragmen hingga 40kb.

Secara umum persiapan untuk PCR membutuhkan beberapa komponen dan reagen, yaitu :

• DNA template yang mengandung DNA target untuk diamplifikasi.
• Satu atau lebih primer, yang akan melengkapi pada daerah DNA pada 5’ (five prime) dan 3’ (three prime)
• DNA polymerase seperti Taq polymerase atau DNA polymerase yang lain dengan temperatur optimum sekitar 70ºC.
• Deoxynucleotide triphosphatase (dNTPs), untuk membuat blok dimana DNA polymerase mensistesis strand DNA yang baru.
• Larutan buffer, untuk menyediakan lingkungan kimiawi yang sesuai untuk aktivitas optimum dan stabilitas dari DNA polymerase.
• Divalent cations, magnesium atau mangan (ion)
• Monovalent cation potassium ion.

PCR digunakan pada volume reaksi 15-100µl pada tube kecil (0,2 – 0,5 ml) thermal cycler. Thermal cycler memanaskan dan mendinginkan tube reaksi untuk mengontrol suhu yang dibutuhkan pada tiap step reaksi.

Figure 2: Schematic drawing of the PCR cycle. (1) Denaturing at 94-96°C. (2) Annealing at ~65°C (3) Elongation at 72°C. Four cycles are shown here.

Initialization step

Terdiri dari reaksi pemanasan ke suhu 94 – 96ºC selama 1 – 9 menit. Hanya digunakan untuk DNA polymerase yang membutuhkan aktivasi panas dengan hot-start PCR.

Denaturation step

Langkah yang biasa dilakukan dan mengandung pemanasan 94 – 98 ºC selama 20 – 30 detik . Akan menyebabkan peleburan dari DNA template dan DNA primer dengan memasukkan hydrogen bond antara complementary bases dari DNA strand, menjadi single strand DNA.

Annealing step

Temperatur reaksi menurun menjadi 50 – 65 ºC selama 20 – 40 detik untuk membiarkan annealing antara primer dan single stranded DNA template. Kestabilan ikatan DNA-DNA hidrogen hanya dibentuk pada saat sequen primer berdekatan dengan sequen template. Ikatan polymerase hingga menjadi primer-template hybrid dan memulai sintesis DNA.

Extension/elongation step

Suhu pada langkah ini tergantung pada langkah dimna DNA polymerase digunakan. Taq polymerase memiliki aktivitas optimum pada suhu 75 - 80 ºC dan umumnya suhu 72 ºC digunakan enzim ini. DNA polymerase mensintesis DNA strand complementary baru hingga DNA template strand dengan menambahkan dNTPs . Extension time berdasarkan pada waktu yang digunakan DNA polymerase dan pada saat pemanjangan dari DNA fragmen untuk amplifikasi.

Final elongation

Biasanya pada suhu 70 - 74 ºC selama 5 – 15 menit setelah siklus PCR selesai dan single-stranded DNA sudah siap.

Final hold

Langkah ini pada suhu 4 - 15 ºC, waktu tidak berbatas.

Figure 3: Ethidium bromide-stained PCR products after gel electrophoresis. Two sets of primers were used to amplify a target sequence from three different tissue samples. No amplification is present in sample #1; DNA bands in sample #2 and #3 indicate successful amplification of the target sequence. The gel also shows a positive control, and a DNA ladder containing DNA fragments of defined length for sizing the bands in the experimental PCRs.

Agarose gel electrophoresis digunakan untuk melihat pemisahan dari produk PCR. Ukuran dari produk PCR dapat diperkirakan dengan membandingkan dengan DNA ladder, yang mengandung DNA fragmen yang diketahui ukurannya, ada di samping produk PCR.

III. MATERI DAN METODE

A. Inokulasi dan Pemanenan Virus Pada Telur Berembrio

Materi

a. Alat :

- Pompa suntik 1 ml dan 5 ml dengan jarum ukuran 27/28.

- Lampu teropong.

- Bor untuk melubangi telur.

- Bejana gelas, cawan petri, nampan (stainless steel), nampan telur (egg tray), tabung reaksi, lampu spiritus, usa, safeti cabinet, kanule.

b. Bahan :

- Telur ayam berembrio.

- Larutan/suspensi antibiotika.

- Larutan PBS pH 7,2.

- Kaldu alkalis.

- Parafin padat.

- Alkohol 70 % dengan preparat Iodium organik.

Metode inokulasi

Pilih telur berembrio yang telah dieramkan 10-14 hari dengan lampu di kamar gelap (candling), apakah embrio mati atau hidup

¯

Telur-telur berembrio yang hidup diberi tanda dengan pensil dimana letak kepala embrio dan batas rongga hawa.

¯

Ambil telur yang akan diinokulasikan, suci hamakan kutub yang mengandung ruang hawa dan kerabang di atas embrio yang telah diberi tanda tadi dengan menggosokkan Iodium tincture atau alkohol 70 % ditambah boicid/betadine.

¯

Buat lubang di atas embrio dan di kutub yang mengandung ruang hawa dengan memakai bor kecil atau gerinda.

¯

Inokulasikan 0,1 ml suspensi virus yang telah disiapkan dengan mempergunakan kanule yang cukup halus ke dalam ruang alantois.

¯

Lubang ditutup dengan parafin yang sudah dicairkan, lubang di kutub juga ditutup dengan parafin.

¯

Eramkan telur berembrio tersebut selama 2-3 hari dalam mesin tetas.

Metode pemanenan

Desinfeksi kutub tumpul dari telur berembrio dengan menggosokkan Iodium tincture atau alkohol 70 % ditambah boicid/betadine.

↓

Dengan pinset tajam pecahkan kerabang telir, buat lubang sebesar / lebih dari rongga hawa. Jika perlu diambil membrane chorio alantois, gunting selaput tadi berbentuk bundaran menurut kehendak kita.

↓

Dengan pinset tekan embrio ke samping, akan terlihat cairan korio alantois di sisi embrio, ambil cairan dengan spuit 5 ml.

↓

Masukkan cairan dalam tabung reaksi dan amati warna dan viskositasnya

B. Uji Hemaglutinasi (HA), Uji Hemaglutination Inhibition (HI) dan Uji Presipitasi Agar (UPA)

Materi

a. Alat :

- Kaca benda - Pelat mikro

- Tusuk gigi - Oven

- Kotak pembaca aglutinasi - Pipet mikro

- Pipet 1 ml dan 5 ml

b. Bahan :

- Cairan korioalantois - 0,1 % Phenol

- Eritrosit ayam 0,5 % dan 2,5 % - 8,5 % NaCl

- PBS (Phosphat Buffer Saline) pH 7 - Larutan agar

- Serum pekat - Virus

Metode Uji Presipitasi Agar

Buat lapisan tipis agar pada kaca benda, bersihkan kaca benda dari kotoran dan lemak, tambahkan 3 ml 0,3 % larutan agar dalam air yang dipanaskan pada penangas air mendidih. Setelah padat kaca benda ditaruh dalam oven 80°C atau tempatkan dalam inkubator 37°C sampai agar kering.

¯

Tempatkan kaca benda yang sudah dilapisi agar pada tempat yang datar. Tambahkan larutan agar 1 % dalam 8,5 % NaCl dalam PBS, tambahkan phenol sebagai pengawet, biarkan agar mengeras.

¯

Buat beberapa sumuran.

¯

Teteskan 0,05 ml anti NDV di tengah sumuran dan pada sumuran disekitarnya ditetesi 0,05 suspensi NDV.

¯

Tempatkan kaca benda pada cawan petri dengan kertas/kapas basah dan batang kaca untuk menempatkan kaca benda.

¯

Tempatkan cawan petri diatas meja datar, amati adanya presipitasi di antara sumuran antigen dan anti serum. Perhatikan adanya garis-garis presipitasi, garis identitas dan non identitas.

Metode Uji HA-HI

¨ HA cepat pada kaca benda

Teteskan setetes cairan korioalantois diatas kaca benda.

¯

Teteskan setetes suspensi eritrosit ayam 2,5 % di dekat tetesan cairan korioalantois, ditempat yang berjauhan teteskan pula suspensi eritrosit ayam sebagai kontrol.

¯

Campur cairan korioalantois dan suspensi eritrosit ayam dengan menggoyang-goyangkan kaca benda atau dengan batang korek api, tusuk gigi atau aplikator.

¯

Tunggu 5 menit.

¯

Periksa di atas kotak pembaca aglutinasi.

¯

HA + akan terlihat adanya suspensi agregat eritrosit yang tampak berkeping-keping.

¯

Bandingkan dengan kontrol, tetesan eritrosit yang tidak dicampur dengan cairan korioalantois.

¨HI cepat pada kaca benda

Teteskan setetes cairan korioalantois di dua tempat yang terpisah 2 cm pada kaca benda.

¯

Teteskan setetes serum anti NDV pada salah satu tetesan cairan

korioalantois, campur dan tunggu 5 menit.

¯

Teteskan eritrosit ayam pada kedua tetesan, campur, tunggu 5 menit, amati di atas kotak pembaca aglutinasi.

¨ HA lambat dengan pelat mikro

Isi lubang no. 1-12 pada pelat mikro dengan PBS 0,05 ml.

¯

Lubang pertama dimasukkan cairan alantois 0,05 ml dengan pipet mikro, campur pakai diluter.

¯

Pindahkan 0,05 ml campuran dari lubang pertama ke lubang kedua dengan diluter, dan dari lubang kedua dipindahkan ke lubang ketiga dan seterusnya sampai lubang ke-11. Dari lubang ke-11 tidak dipindahkan ke lubang 12 tapi dibuang.

¯

Masukkan eritrosit ayam 0,5 % sebanyak 0,05 ml ke lubang 1-12.

¯

Tunggu sampai lubang ke-12 terjadi endapan eritrosit, amati.

¨ HI lambat dengan pelat mikro

Masukkan 0,025 ml PBS ke lubang 1-12 menggunakan pipet/dropper ,

0,025 ml

¯

Masukkan serum pekat 0,025 ml ke lubang pertama, campur memakai diluter 0,025 ml, masukkan ke lubang ke-2 dan seterusnya sampai lubang ke-10.

¯

Masukkan PBS 0,025 ml hanya pada lubang 1 dan 12.

¯

Masukkan virus 4 HA pada lubang 2-11 sebanyak 0,025 ml menggunakan pipet 0,025 ml.

¯

Campur dengan menggoyangkan plate, tunggu 30 menit.

¯

Masukkan eritrosit ayam 0,5 % sebanyak 0,05 ml ke lubang 1-12.

¯

Tunggu sampai lubang 12 terjadi endapan eritrosit, amati.

IV. HASIL PRAKTIKUM

1. Inokulasi Virus Pada Telur Berembrio.

Inokulasi dilakukan pada ruang korio-alantois, dan hasil yang didapatkan jika positif atau terdapat adanya virus ND adalah embrio pada telur ayam akan menunjukkan gejala adanya hemoragi pada daerah kepala dan leher serta terlihat kerdil atau kecil embrionya, dibanding dengan normalnya. Pada percobaan inokulasi virus pada telur ayam berembrio ini. Kelompok kami ternyata tidak menemukan adanya hemoragi pada daerah kepala dan leher. Dapat dikatakan virus tidak tumbuh, pada kedua telur tersebut.

Gambar : embrio yang terkena virus ND

Gambar : embrio kontrol

2. Uji Presipitasi Agar.

Sumuran yang telah diberi substrat virus dan serum di inkubasi pada suhu 37⁰C selama 2 hari, menunjukkan hasil negatif, terlihat tidak terbentuk garis presipitasi yang berarti tidak ada ikatan antara antigen dengan antibodi.

Tidak ada garis presipitat

Jika terjadi garis presipitat maka :

3. Uji HA-HI

a. Uji HA cepat pada kaca benda

· Eritrosit ayam + cairan korioalantois ® tampak suspensi agregat eritrosit

· Eritrosit ayam tanpa cairan korioalantois ® tidak ada suspensi agregat eritrosit

b. Uji HI cepat pada kaca benda

· Cairan korioalantois + serum anti NDV + eritrosit ayam ® tidak terjadi aglutinasi

· Cairan korioalantois + eritrosit ayam ® tampak adanya aglutinasi

c. Uji HA lambat pada pelat mikro

End point dilihat dari yang tertinggi yaitu pada lubang nomor 4. Jadi jumlah titer virus adalah 2⁴ = 16 unit HA yang berarti di dalam 0,05 ml cairan chorioalntois terdapat 16 unit virus yang mampu menghemaglutinasi eritrosit.

d. Uji HI lambat pada pelat mikro

Eritrosit yang meleleh dilihat pada lubang paling kecil yaitu pada lubang nomor 6. Jadi titer antibodi adalah 2⁶ = 64 unit HI yang berarti, di dalam 0,025 ml serum terdapat 64 unit antibodi yang menghambat hemaglutinasi eritrosit.

V. PEMBAHASAN

1. Inokulasi telur dengan virus ND

Pada percobaan ini dilakukan penanaman virus pada ruang korio allantois, telur yang digunakan adalah telur SPF (Spesific Pathogenic Free), artinya telur tersebut tidak mengandung bakteri – bakteri patogen yang dapat menimbulkan antibodi dalam telur tersebut sehingga dapat menimbulkan kegagalan pertumbuhan bagi virus yang akan ditanam. Virus yang ditanam adalah virus ND, untuk dapat menanam virus secara in ovo ini digunakan telur ayam berembrio dengan kondisi embrio masih hidup.

Pertama kali yang harus dilakukan adalah telur berembrio yang berumur 9–11 hari diteliti dengan lampu teropong di kamar gelap untuk mengetahui apakah embrio tersebut masih hidup atau sudah mati, indikasi bahwa embrio tersebut masih hidup adalah adanya gerakan embrio di dalam telur (embrio akan menjauhi sinar), dan adanya pembuluh darah. Digunakan TAB umur 9–11 hari karena, pada saat itu ruang dan cairan korio-alantoisnya sedang berkembang sehingga daerahnya menjadi luas, maka inokulasi pada ruang alantois ini akan lebih mudah dan mengurangi resiko.

Kemudian bagian atas dan rongga hawa embrio diberi tanda pada kulit telurnya. Kedua tanda ini dilubangi setelah kulit telur didesinfeksi dengan menggunakan alkohol dan iodium untuk menjaga agar daerah sekitar lubang tetap aseptis. Kemudian inokulasi virus dilakukan dengan cara memasukkan suspensi virus ke dalam lubang yang berada di atas embrio dengan menggunakan spuit 1 ml, ukuran jarum 28 G. Penyuntikan dilakukan dengan sudut 45⁰ ke arah bagian runcing telur agar tidak mengenai embrio. Injeksi dilakukan ke dalam cairan corioalantois untuk membuat daerah aman sehingga lingkungan internal embrio tidak terganggu dan agar virus mudah menyebar dan melekat pada sel yang mempunyai reseptor yang cocok dengan virus

Penambahan bahan ke dalam telur akan meningkatkan tekanan di dalam telur yang dapat mempengaruhi pertumbuhan embrio dan virus, oleh karena itu dibuatlah lubang pada kulit telur di atas rongga hawa untuk membuat jalan keluar sedikit udara sehingga tekanan dalam telur tetap konstan saat diinokulasi. Kemudian kedua lubang ditutup dengan menggunakan parafin solidum untuk mengembalikan kondisi dalam telur yang steril, terhindar dari kontaminasi lingkungan luar. Inokulasi ini dilakukan di dalam safety cabinet bertujuan untuk mengurangi kontaminasi. Telur yang telah diinokulasi kemudian dieramkan pada suhu 37 ⁰ C selama 2–3 hari untuk kemudian diamati pertumbuhan embrio, perubahan yang terjadi, dan dilakukan panen virus.

Setelah selesai dieramkan kemudian dilakukan panen virus yang bertujuan untuk mengumpulkan virus yang telah dibiakan (dengan mengambil cairan allantois atau seluruh embrio) dan melihat perubahan – perubahan anatomi patologi pada selaput korio allantois dan pada embrio. Sebelum embrio di panen, di masukkan dalam almari es selama 18 jam dengan tujuan supaya embrionya mati dan mengecilkan pembuluh darah.

Setelah diinkubasi 2-3 hari, telur dimasukkan ke dalam refrigerator 18 – 24 jam untuk memastikan embrio benar-benar mati, setelah itu, perkembangan virus dapat diamati. Pertama–tama dilakukan desinfeksi kutub tumpul dari telur–telur berembrio dengan menggosokkan alkohol lalu disulut dengan api desinfeksi dapat pula dengan menggunakan alkohol 70 % ditambah biocid atau yodium tincture. Cara membuka embrio adalah dengan menggunakan pinset, embrio dibuka pada bagian rongga udara, lalu selaput corioallantois dibuka, embrio dipinggirkan dengan menggunakan pinset dipinggirkan embrionya untuk mendapatkan rongga korioallantois. Kemudian cairannya diambil dengan menggunakan spuit. Pada penanaman virus di membran korioalantois, pemanenan dilakukan pada membran tersebut. Hasil panen berupa membran chorioalantois yang nantinya dapat dibuat suspensi virus. Cairan korioalantois yang bagus akan memperlihatkan warna jernih, sedang cairan yang menunjukkan pertumbuhan virus memperlihatkan warna yang keruh dan kadang terjadi hemorrhagi. Embrio telur diambil dan diamati, amati pertumbuhan, perubahan yang terjadi, dan Cytophatic effect. Terdapat lesi-lesi patologi dan cairan chorioalantois mengalami hemoragi. Cytophatic Effect adalah perubahan pada morfologi sel embrio yang disebabkan oleh virus.

Inokulasi yang dilakukan pada ruang korio-alantois, akan didapatkan hasil jika positif atau terdapat adanya virus ND maka embrio pada telur ayam akan menunjukkan gejala adanya hemoragi pada daerah kepala dan leher serta terlihat kerdil atau kecil embrionya, dibanding dengan normalnya. Pada percobaan inokulasi virus pada telur ayam berembrio ini. Tiap kelompok diberi 2 butir telur yang diberi perlakuan sama. Pada kelompok kami ternyata tidak menemukan adanya hemoragi pada daerah kepala dan leher. Dapat dikatakan virus tidak tumbuh, pada kedua telur tersebut. Pada awalnya kami mengira virus tersebut tumbuh karena pada salah satu embrio terlihat adanya tubuh yang kecil dan kerdil. Tapi ternyata bukan karena tumbuhnya virus tetapi karena umur embrio yang digunakan belum ada 10 hari sehingga terlihat kecil dan kerdil.

Tujuan dari percobaan ini adalah untuk mengetahui kultur virus dengan menggunakan telur. Kultur virus dapat dilakukan dengan cara in vivo yaitu dalam hewan percobaan, secara in ovo dengan menggunakan telur dan secara in vitro dengan menggunakan kultur sel. Percobaan menanam virus ND dilakukan dengan telur usia 9-10 hari karena pada waktu tersebut ruang alantois berkembang sempurna sehingga cairan alantois akan menjadi banyak dan memungkinkan virus untuk tumbuh dengan optimal. Digunakan telur SPF (Spesific Pathogen Free) dari induk yang sehat dan tidak divaksin. Telur ini dapat digunakan untuk inokulasi dengan baik tanpa adanya kontaminasi dari berbagai parasit ataupun bakteri yang dapat ditularkan dari induk jika induk pernah terinfeksi atau mendapatkan antibodi kekebalan dari induk. Selain embrio telur, media lain yang dapat digunakan untuk inokulasi virus antara lain; hewan coba, kultur jaringan, kultur sel, dan kultur in vitro.

Syarat media agar virus dapat tumbuh yaitu:

1. Media berupa sel hidup karena virus hanya dapat bereplikasi di dalam sel hidup.

2. Media berisi vitamin dan nutrisi.

3. Media harus steril (SPF).

4. Media mempunyai reseptor yang cocok dengan virus.

2. Uji Agar Gel Presipitasi

Uji Presipitasi Agar atau nama lainnya adalah Double Immunodiffusion Test atau Ouchterlowy’s Test bertujuan untuk mengetahui apakah serum atau antibody yang ditest merupakan antibodi spesifik terhadap virus yang digunakan yang telah diketahui. Uji ini dapat pula digunakan untuk mengetahui virus spesifik yang dapat bereaksi dengan antibodi yang telah diketahui. Jadi proses reaksinya dapat dibalik. Pada uji agar gel presipitasi digunakan media purified agar semisolid. Prinsipnya adalah adanya ikatan antara antibody spesifik dengan antigen.

Dalam percobaan, dibuat tiga sumuran pada medium purified agar semisolid. Sumuran yang berada di tengah ditetesi dengan antibodi virus ND dan dua sumuran yang lain ditetesi dengan antigen virus. Kemudian inkubasi pada suhu 37⁰C selama 2 hari. Suhu tersebut adalah suhu tubuh yang merupakan suhu yang baik bagi pertumbuhan virus, sedangkan waktu 24 jam merupakan waktu minimal yang diperlukan virus untuk tumbuh.

Setelah diamati didapat hasil negatif, dimana tidak terjadi garis presipitat diantara ketiga sumuran. Hal ini dapat terjadi karena konsentrasi virus atau antigen tidak seimbang, dan bisa juga disebabkan karena antibodi yang digunakan bukan merupakan antibodi spesifik, sehingga pita-pita akan terus terbentuk tetapi larut dan tidak mengendap dalam kecepatan yang sama sehingga tidak teridentifikasi.

Keberhasilan uji ini ditentukan oleh :

1. Keseimbangan konsentrasi antigen dan antibodi

2. Jarak antara sumuran

3. Kedalaman sumuran

4. pH yang sesuai

5. Suhu (37⁰C)

6. Kelembaban (70 – 80%).

3. Uji HA-HI

a. Uji HA cepat

Virus yang digunakan dalam praktikum ini adalah virus ND. Tujuan dari uji HA adalah mengetahui kemampuan virus mengaglutinasi eritrosit. Prinsipnya adalah terjadi ikatan antara antigen virus dengan eritrosit ayam sehingga terjadi hemaglutinasi.

Percobaan dilakukan dengan memberikan satu tetes cairan korioalantois yang mengandung virus ND di atas kaca benda yang bersih dan kering. Di dekat tetesan tersebut diteteskan suspensi eritrosit ayam 2,5% dan teteskan satu tetes lagi suspensi tersebut di tempat yang agak berjauhan tanpa diberi cairan korioalantois untuk digunakan sebagai kontrol. Untuk mencampur suspensi dan eritrosit, kaca benda digoyangkan sedikit, dan tunggu selama 5 menit.

Eritrosit yang diberi suspensi virus terlihat agregat karena adanya proses hemaglutinasi dari protein hemaglutinin virus terhadap eritrosit. Sedangkan pada kontrol terlihat adanya endapan eritrosit. Jadi, pada uji HA cepat ini menunjukkan bahwa virus mempunyai kemampuan menghemaglutinasi karena memiliki hemaglutinin. Proses hemaglutinasi ditandai dengan munculnya agregat seperti pasir pada suspensi.

b. Uji HI cepat

Uji HI cepat bertujuan untuk mengidentifikasi virus dengan antibodi yang spesifik. Prinsip kerjanya adalah terjadi ikatan antara antibodi virus dengan eritrosit ayam sehingga hemaglutinasi terhambat. Uji ini hanya dilakukan jika virus mampu menghemaglutinasi eritrosit.

Pada kaca benda diteteskan satu tetes cairan corioalantois yang mengandung virus pada kaca benda di dua tempat yang berbeda. Di dekat salah satu tetesan diberikan serum anti-ND virus, sedang tetesan yang lain sebagai control dan tunggu selama 5 menit. Setelah itu ditambahkan suspensi eritrosit ayam 2,5% dan kemudian dicampur.

Eritrosit yang diberi virus dan serum anti-ND tidak mengalami hemaglutinasi, ditunjukkan dengan terbentuknya endapan eritrosit. Sedangkan eritrosit yang hanya diberi virus menunjukkan terjadinya proses hemaglutinasi dengan munculnya agregat berwarna putih. Dapat disimpulkan bahwa virus yang diteteskan merupakan virus ND karena mampu berikatan dengan antibodi yang terdapat di dalam serum anti virus ND sehingga kemampuan menghemaglutinasi eritrosit terhambat.

Pada uji cepat terlihat darah tidak mengalami aglutinasi karena tidak terdapat antigen virus dalam cairan korioalantois yang dipakai sehingga tidak terjadi proses aglutinasi.

c. Uji HA lambat

Uji HA lambat dengan pelat mikro ini bertujuan untuk mengetahui jumlah titer virus. Titer virus adalah pengenceran tertinggi dari virus yang masih mampu mengaglutinasi eritrosit.

Uji ini dimulai dengan memasukkan 0,05 PBS engan menggunakan dropper ke dalam 12 sumuran dalam pelat mikro. Kemudian pada sumur pertama diberi 0,05 ml cairan korioalantois yang mengandung virus. Selanjutnya, dengan menggunakann diluter 0,05 ml cairan dipindahkan dari sumuran 1 ke sumuran 2, dari sumuran 2 ke sumuran 3 dan seterusnya sampai sumuran ke-11. lalu ke dalam sumuran 1 s.d 12 diteteskan 0,05 ml eritrosit ayam 0,5%. Pengamatan dilakukan setelah eritrosit dalam sumuran ke-12 mengendap.

Pada uji HA lambat dapat diamati bentuk hemaglutinasi eritrosit pada dasar tabung. Uji positif ditandai dengan terbentuknya endapan seperti bunga sedangkan hasil negatif ditunjukkan dengan terbentuknya endapan eritrosit di dasar tabung. Untuk uji HA lambat teramati reaksi hemaglutinasi pada pelat mikro rata-rata sampai pelat yang ketiga dan keempat. Titer virus yang diperoleh adalah 2⁶ = 32 unit HA, yang berarti di dalam 0,05 ml cairan allantois terdapat virus 32 unit HA (unit HA adalah satuan penghitungan virus yang mampu menghemaglutinasi eritrosit).

d. Uji HI lambat

Uji HI lambat bertujuan untuk menentukan titer antibodi yang ada dalam serum darah ayam dan mampu digunakan untuk mengetahui sejauh mana tingkat kekebalan ayam terhadap virus tersebut. Titer antibodi yaitu pengenceran tertinggi dari serum yang masih mampu menghambat reaksi aglutinasi eritrosit Pada uji lambat digunakan pelat mikro sebanyak 4 baris, hal ini dimaksudkan agar hasil yang didapat lebih akurat yaitu dengan merata- ratakan hasil yang didapat dari tiap baris.

Yang menjadi kontrol virus adalah lubang nomor 11, kontrol eritrosit adalah lubang nomor 12 dan kontrol serum adalah lubang nomor 1. Uji dimulai dengan memasukkan 0,025 ml PBS ke dalam sumuran 1-12 dengan menggunakan dropper. Kemudian, ke dalam sumuran 1 dimasukkan 0,025 ml serum ND pekat. Langkah selanjutnya adalah memindahkan campuran dari sumuran 1 ke sumuran 2, dari sumuran 2 ke sumuran 3, dan seterusnya sampai sumur ke-10 dengan menggunakan diluter. Kemudian ke dalam sumuran 2 hingga 11 dimasukkan 0,025 ml virus 4 HA, virus 4 HA yaitu virus yang sudah mengalami pengenceran 4 x dengan cara mencampur 1 bagian virus dengan 3 bagian pengencer. Setelah ditunggu 30 menit (agar reaksi berlangsung sempurna), ke dalam sumuran 1-12 dimasukkan 0,05 ml eritrosit ayam 0,5% dan kemudian ditunggu sampai mengendap. Hasil positif ditunjukkan dengan endapan eritrosit yang terbentuk di dasar tabung karena hemaglutinasi dihambat, sedangkan hasil negatif ditunjukkan dengan tidak adanya endapan, yang berarti eritrosit terhemaglutinasi.

Pada uji ini diperoleh hasil sumuran yang tidak terjadi endapan (hemaglutinasi dihambat) adalah sumuran 1 s.d sumuran 6, titer virus yang didapat adalah 2⁹ = 512 unit HI yang artinya di dalam 0,025 ml serum terdapat 512 unit antibodi yang mampu menghambat hemaglutinasi.

Jika titer antibodi terhadap virus tinggi maka prognosanya baik karena tubuh mempunyai respon yang baik dalam upaya untuk mengatasi gangguan infeksi.

Cara Memperoleh Virus 4 HA

§ Ayam yang sakit diambil dan diperiksa, diperhatikan adanya gejala klinis yang menonjol atau spesifik.

§ Ayam dibedah diambil organ-organ (predileksi) yang erat kaitannya dengan gejala penyakit tersebut, dalam hal ini Newcastle Disease.

§ Organ didalam mortir, ditambah PBS 1:4 sehingga diperoleh suspensi dari organ.

§ Suspensi dimasukkan kedalam tabung dan disentrifuse selama 15 menit, 3000 rpm.

§ Bagian (cairan) supernatan dipindah kedalam tabung baru dan diberi antibiotik.

Contoh antibiotik yang dapat digunakan adalah Penisilin dan Sterptomisin. Selanjutnya di inkubasi 37^oC selama 2,5 jam.

§ Kemudian supernatan tersebut ditanam dalam PAD, diinkubasi 18-24 jam dan diamati ada tidaknya pertumbuhan bakteri. Bila tidak ada, supernatan yang telah diinkubasi ditanam ke dalam telur ayam berembrio yang bebas kuman pathogen spesifik (SPF).

§ TAB tersebut diinkubasi pada mesin tetas telur 3-5 hari, sebagai control diinkubasikan juga TAB (Telur Ayam Bertunas) normal.

§ Setelah diinkubasi TAB yang telah dipropagasi dimasukkan ke dalam refrigerator semalam penuh untuk memastikan embrio benar-benar mati dan untuk vasokonstriksi pembuluh darah.

§ Telur diambil, bagian rongga udara dibuka, embrio disisihkan, cairan dalam ruang propagasi dipanen, cairan tersebut diharapkan tumbuh banyak virus.

§ Untuk mengetahui bahwa virus tersebut tumbuh, maka embrio dikeluarkan dan diamati adanya perubahan-perubahan patologi-anatomi ukuran embrio dibandingkan dengan yang normal. Bila ada pertumbuhan virus maka ukuran embrio lebih kecil atau embrio tidak berkembang. Selanjutnya dapat dilakukan uji HA.

§ Setelah uji HA lambat didapat jumlah titer virus sebanyak 2⁴ = 16 HA unit. Hasil tersebut dibagi 4, jadi 16/4 = 4. Jadi untuk mendapat virus 4 HA maka 1 bagian virus ditambah dengan 3 bagian PBS.

Cara Memperoleh Eritrosit 0,5% Dan 2,5%

q Darah diambil, dimasukkan dalam tabung steril, diberi antikoagulan 1:5, kemudian disentrifuse selama 1 menit. Bagian supernatan di buang. Contoh antikoagulan yang adapat digunakan adalah EDTA, heparin, atau sitrat.

q Endapan eritrosit dicuci dengan PBS hingga volumenya sama dengan volume darah semula. Tabung digoyang-goyangkan kemudian disentrifuse lagi selama 1 menit. Pencucian dilakukan 3X.

q Pada pencucian yang terakhir, supernatan dibuang. Eritrosit ditambah lagi PBS, kemudian dimasukkan dalam tabung PCV, disentrifuse 15 menit.

q Dalam hal ini PCV (%) adalah angka yang tertera pada pengendapan eritrosit dalam tabung PCV.

q Misal PCV 10 % untuk membuat konsentrasi 2,5 % maka (10 : 2,5 = 4) dibuat 1 bagian eritrosit dalam 3 bagian PBS.

q Sedangkan untuk membuat konsentrasi 0,5% maka (10 : 0,5 = 20), jadi dibuat 1 bagian eritrosit dalam 19 bagian PBS.

VI. KESIMPULAN

1. Virus ND (Newcastle Disease) diinokulasi pada cairan allantois telur berembrio yang berusia 9-10 hari.

2. Virus ND dapat dikumpulkan dengan mengambil cairan allantois, dan diuji dengan HA/HI test dengan serum anti ND.

3. Pada uji presipitasi agar (UPA) terbentuk garis presipitasi, yang menunjukkan terjadi ikatan antigen dengan antibody dan membuktikan bahwa virus tersebut adalah virus ND.

4. Pada uji hemaglutinasi (HA) cepat terjadi hemaglutinasi antara eritrosit dengan virus yang di tunjukan dengan adanya agregat/presipitat berwarna putih yang berarti virus memiliki hemaglutinin.

5. Pada uji HI cepat tidak terjadi hemaglutinasi karena tidak ada ikatan antara eritrosit dan virus karena sudah ada anti virus.

6. Pada uji HA lambat dapat ditentukan titer virus 2⁶ = 32 unit HA

7. Pada uji HI lambat dapat ditentukan titer antibodi 2⁹ = 512 unit HI

DAFTAR PUSTAKA

Fenner. F. 1993. Virology Veteriner Edisi kedua. New York: Academic Press Inc.

Jawetz, dkk, 1996. Mikrobiologi Kedokteran edisi 20. Jakarta: Binarupa Aksara

Merchant, Ival Arthur. Veterinary Bacteriology and Virology, 4^th edition. The Iowa State College Press. Ames, Iowa.

Merchant and Packer. 1994. Veterinary Bacteriology and Virology. USA: Iowa State University Press

Purchase. H. G., 1989. A Laboratory Manual for the Isolation and Identification of Avian Phatogens, Third Edition. Amerika: Kendal/hint Publishing Company

Tabbu, C.Rangga. 2000. Penyakit Ayam Dan Penanggulangannya. Yogyakarta: Kanisius

Diagrammatic representation of Newcastle disease virus, http://www.fao.org/DOCREP/005/AC802E/ac802e0o.htm

http://images.google.co.id/imgres?imgurl=http://www.brandeis.edu/projects/wanghlab/images/newcastlevirus.gif&imgrefurl=http://www.brandeis.edu/projects/wanghlab/applicationsNewcastle.html&h=243&w=389&sz=16&hl=id&start=23&tbnid=p1uX8ORGrZ94cM:&tbnh=77&tbnw=123&prev=

http://images.google.co.id/imgres?imgurl=http://www.nature.com/ncponc/journal/v4/n2/images/ncponc0736-f4.jpg&imgrefurl=http://www.nature.com/ncponc/journal/v4/n2/fig_tab/ncponc0736_F4.html&h=398&w=450&sz=38&hl=id&start=17&tbnid=uBs-8zwcZJ_faM:&tbnh=112&tbnw=127&prev=

http://images.google.co.id/imgres?imgurl=http://www.urbanwildlifesociety.org/WLR/Tabl32.14PMV.gif&imgrefurl=http://www.urbanwildlifesociety.org/WLR/PMV-RH%26H-WWW.htm&h=244&w=282&sz=10&hl=id&start=26&tbnid=WY6VJj6vM17AWM:&tbnh=99&tbnw=114&prev=

http://www1.fao.org/media_thumbs/Photos/1995/Apr1995/Thumbs_384/17857.jpg

Shane, simon M. Buku Pedoman Penyakit Unggas. American Soybean Assosiation; Singapore.

(www.poultryindonesia.com)

http://www.vet.uga.edu/vpp/gray_book02/fad/vnd.php

http://en.wikipedia.org/wiki/Newcastle_disease

http://images.google.co.id/imgres?imgurl=http://www.thepoultrysite.com/diseaseinfo/contents/Paramyxovirus1Fig1.jpg&imgrefurl=http://www.thepoultrysite.com/diseaseinfo/111/newcastle-disease-paramyxovirus-1&h=179&w=229&sz=8&hl=id&start=133&tbnid=Z97QQFMoZY2AOM:&tbnh=84&tbnw=108&prev=