Jumat, 21 Mei 2010

KRIOPRESERVASI OOSIT

KRIOPRESERVASI OOSIT PADA MAMMALIA

PENDAHULUAN

Teknik kriopreservasi pada berbagai sel, jaringan,dan organ telah banyak dilakukan, demikian juga dengan kriopreservasi oosit walaupun tidak sebanyak embrio. Salah satu cara penyediaan oosit yang telah banyak dilakukan adalah pengawetan dengan metode freezing atau pembekuan dengan cara slow freezing dan rapid freezing. Namun, saat ini telah dikembangkan pembekuan oosit dengan metode vitrifikasi yang lebih mudah dilakukan dan jauh lebih sederhana.

Pada tahun-tahun terakhir ini, banyak penelitian yang lebih diarahkan pada pembekuan oosit sebagai alternatif pengganti pengawetan embrio. Demikian juga dengan teknologi bantu reproduksi pada hewan, keberhasilan pembekuan embrio ini kemudian diikuti dengan berbagai penelitian mengenai kriopreservasi oosit sebagai alternatif penyediaan gamet. Tidak seperti pada kriopreservasi embrio, studi mengenai kriopreservasi oosit sering tidak terduga hasilnya dan penggunaan prosedur kriopresevasi ini secara komersial masih sangat terbatas (Shaw et al., 2000).

Etilen glikol, Gliserol, DMSO, dan PROH sebagai krioprotektan yang akan dipakai memiliki perbedaan alamiah biokimia, dan dapat dipakai secara konvensional untuk kriopreservasi pada oosit sapi. Karena DMSO dan PROH keduanya memiliki membrane permeabilitas yang tinggi daripada gliserol, kemampuan hidup post thawing dari oosit yang dibekukan pada stadium matang mungkin dapat diperbaiki dengan menggunakan DMSO atau PROH.

Oleh karena itu, kita mengevaluasi aksi kriopreservasi dari Etilen Glikol, gliserol, DMSO, dan PROH pada oosit sapi mature in vitro. Kita memilih slow freezing method yang dikombinasikan dengan protocol thawing tiga tahap, sebelumnya memakai oosit mature. Penetrasi sperma in vitro dari oosit frozen-thawed dan perkembangan in vitro dari oosit yang diinseminasikan menuju stadium blastosist adalah perlu dievaluasi untuk dinilai kapasitas kriopreservasi dari krioprotektan ini.

Makalah ini dibuat untuk mengetahui tingkat keberhasilan metode kriopreservasi dengan memakai krioprotektan yang berbeda (Etilen Glikol, Gliserol, DMSO, PROH) sebagai salah satu cara pembekuan oosit, sehingga mendapatkan hasil yang paling optimal.

TINJAUAN PUSTAKA

Kriopreservasi dapat disimpan dalam waktu yang lama dari sel dan jaringan seperti sejumlah sel yang dapat diterima yang dapat hidup melampaui batas berikutnya. Kemampuan untuk dapat menerapkan teknik kriopreservasi pada oosit menguntungkan area reproduksi. Kriopreservasi dapat meringankan oosit yang baru dikoleksi, dengan cara demikian mempermudah pengelolaan sumber daya genetik (penyimpanan oosit) pada spesies domestik dan eksotik. Pada dekade baru ini kriopreservasi oosit sangatlah penting digunakan pada hewan eksotik atau wild animal dalam rangka konservasi atau pelestarian hewan yang langka. Jika ini benar-benar dapat dikembangkan, bisa saja akan dapat mengurangi angka kepunahan hewan langka di Indonesia, karena oosit dikoleksi, diawetkan, fertilisasi in vitro dan dikembangkan kedalam tubuh hewan sehingga kelestarian hewanpun dapat dipertahankan.

Kriopreservasi dari gamet betina (oosit yang belum mature, yang sedang mature, atau yang sudah mature) di hewan adalah penting sekali dalam menetapkan suatu bank oosit untuk memelihara sumber daya genetik alami. Menurut Lim et al (12,13) pertamakali dilaporkan bahwa sedikit jumlah dari oosit sapi yang dibekukan dan dithawing pada fase metaphase II (stadium mature), akan berkembang menuju stadium blastosist dikultur yang memakai IVF. Usaha selanjutnya adalah membuat teknik mengembangkan kriopreservasi dari oosit sapi memakai pembekuan konvensional/ slow dan metode vitrifikasi. Sekarang ini, produksi dari keturunan oosit yang di bekukan dan dithawing pada stadium matang pada in vitro fertilisasi telah dilaporkan. Namun demikian, hal ini menjadi pertimbangan pada umumnya bahwa oosit sangat sensitif pada bentuk yang beragam dari kerusakan freezing dengan perubahan osmotic dan pendinginan, dan bahwa seperti hasil dari kerusakan pada perkembangan embrio yang tidak baik setelah fertilisasi.

Angka pendinginan lebih cepat menurunkan toksisitas krioprotektan dan juga mengurangi lamanya waktu oosit yang terbuka pada temperatur yang lebih sensitif. Sebagai hasil dari keuntungan ini, vitrifikasi menjadi cara yang menjanjikan untuk kriopreservasi dari oosit dan embrio mamalia. Lebih dari itu, cara ini simple, cepat, dan tidak begitu mahal.

Protokol kriopreservasi dari sperma dan oosit akan memberikan pengawasan yang penting selama persilangan induk pada program breeding yang selektif. Pembekuan sperma adalah biasa untuk beberapa spesies, sedangkan pembekuan oosit meninggalkan beberapa permasalahan, dengan tingkat kesuksesan hampir sedikit (Tervit, 2005)

Vitrifikasi dimungkinkan dapat meningkatkan kelangsungan hidup oosit setelah pencairan. Penggunaan cryoprotektan pada vitrifikasi untuk menekan pembentukan kristal es. Waktu pencahayaan oosit pada larutan cryoprotektan berpengaruh pada efek toksik dari cryoprotektan tersebut. Oleh karena itu, konsentrasi yang tinggi diperlukan dengan waktu ekuilibrasi pendek dan juga sebaliknya

MATERI DAN METODE (PROTOKOL KRIOPRESERVASI)

Dua teknik utama yang dipakai untuk kriopreservasi oosit adalah dengan Slow Freezing dan rapid freezing. Dua cara ini telah dipakai untuk cryoconservation (konservasi) oosit mamalia dengan fariasi yang tinggi.

Krioprotektan yang dipakai adalah:

1. Etilen glikol

2. Gliserol

3. DMSO

4. PROH

Krioprotektan Etilen Glikol

Setelah maturasi, oosit yang matang di pindahkan ke cawan petri yang berisi medium vitrifikasi, masing-masing mengandung 30-40 oosit. Oosit didalam krioprotektan ini dipaparkan pada suhu ruangan selama 10 menit, 20 menit, dan 30 menit. Selesai pemaparan, oosit siap dikemas dalam ministraw transparan 0,25 cc (French straw) yang sudah mengalami Open Pulled Straw (OPS) (Vajta et al., 1998). Cara pengemasan dilakukan sebagai berikut: aspirasi diluen 1M Sukrosa ke dalam straw sepanjang 3 cm, kemudian dibuat rongga udara 0,25 cm. Sebanyak 6-16 oosit diaspirasi sepanjang 3 cm, setelah itu dipisahkan kembal i dengan rongga udara 0,25 cm. Rongga sisanya diisi dengan diluen 1 M Sukrosa dalam PBS. Segera setelah pengemasan, ministraw langsung dicelupkan ke dalam nitrogen cair, dan dibekukan selama 2 – 4 minggu. (Rimayanti, 2005)

Pencairan kembali dilakukan dengan memasukkan ministraw ke dalam penangas air 30 °C. Oosit yang telah dikeluarkan dari ministraw dibilas 2 x dengan sukrosa 0,5 M (Sun et al., 1995).

Oosit diperiksa di bawah mikroskop inverted untuk diamati kualitasnya berdasarkan penilaian morfologis normal sebagai berikut: plasma membrane intak, ooplasma bergranulasi homogen, zona pelusida dan ooplasma berbatas jelas. Sedangkan morfologi oosit yang tidak normal menunjukkan bentuk yang tidak teratur dan terjadi degenerasi dengan ooplasma gelap dan berfragmentasi. Terhadap oosit ditambahkan bahan pewarnaan propidium iodide, kemudian preparat ini diinkubasi dalam inkubator selama 30 menit. Gambaran yang terlihat di bawah mikroskop fluoresen adalah bila oosit hidup, ooplasmanya tidak akan menyerap warna (putih) dan bila oosit mati, ooplasmanya berwarna merah. Menurut Rimayanti (2005) untuk melihat presentase hidup oosit setelah vitrifikasi dengan Etilen Glikol digunakan Rancangan Acak Lengkap pola faktorial dengan 6 perlakuan dan 4 kali ulangan pada setiap kelompok perlakuan. Oosit dibagi dalam 6 kelompok perlakuan sebagai berikut : Kelompok 1, krioprotektan EG+S waktu pemaparan 10 menit; Kelompok 2, krioprotektan EG+S waktu pemaparan 20 menit; Kelompok 3, krioprotektan EG+S waktu pemaparan 30 menit ; Kelompok 4, krioprotektan EG+S+BSA waktu pemaparan 10 menit; Kelompok 5, krioprotektan EG+S+BSA waktu pemaparan 20 menit; Kelompok 6, krioprotektan EG+S+BSA waktu pemaparan 30 menit . Uji statistik yang digunakan adalah Analisis Variansi (Anava), bila terdapat perbedaan yang nyata di antara perlakuan, maka akan dilanjutkan dengan uji Beda Nyata Terkecil (BNT) untuk mengetahui perlakuan terbaik (Steel dan Torie, 1991).

Tabel 1. Rata-rata persentase (+ SD) oosit hidup setelah vitrifikasi dengan krioprotektan EG+S dan EG+S+BSA

Krioprotektan

% Oosit hidup (x + SD)

EG + S

EG + S + BSA

75,90 + 12,61

83,65 + 14,47

Rata-rata persentase oosit hidup terlihat pada Tabel 1. Uji menunjukkan bahwa masing-masing krioprotektan tersebut tidak terdapat perbedaan yang bermakna (p >0,05). Menurut laporan Gordon (1994), EG efektif digunakan sebagai krioprotektan untuk kriopreservasi embrio dan diaplikasikan pula pada kriopreservasi oosit. Berat molekul EG yang rendah (62,07) memberikan efek yang menguntungkan berupa permeabilitas yang lebih tinggi. Beberapa peneliti juga mengatakan bahwa kelebihan EG sebagai krioprotektan adalah karena toksisitasnya yang rendah. Hasil penelitian ini ternyata menunjukkan bahwa krioprotektan berkonsentrasi tinggi ini dapat mempertahankan daya hidup oosit sapi setelah proses vitrifikasi dan pencairan kembali. Berarti problem utama yang berkaitan dengan toksisitas krioprotektan dapat diatasi dengan menggunakan formulasi krioprotektan ini.

Penambahan 6% bovine serum albumin (BSA) sebagai molekul makro juga tidak memperlihatkan adanya pengaruh terhadap daya hidup oosit ( p>0,05). Hal ini didukung oleh pernyataan Pugh et al. (1994) dalam penelitiannya yang membuktikan bahwa penambahan BSA tidak memberikan pengaruh terhadap daya hidup embrio pada fase morula dan blastula. Supriatna dan Pasaribu (1992) menegaskan pula bahwa meskipun serum atau BSA merupakan komponen baku medium pupukan, terutama karena BSA berguna untuk viabilitas embrio in vitro, namun secara umum nilai BSA sebagai krioprotektan ekstraseluler dapat diabaikan dan tingkat kegunaannya dalam proses pembekuan tidak jelas, sehingga dapat dikatakan bahwa untuk proses vitrifikasi oosit sapi tidak diperlukan BSA sebagai tambahan makromolekul. Analisis hasil statistik memperlihatkan bahwa antara masing-masing lama waktu pemaparan, yaitu 10 menit tidak berbeda dengan 20 dan 30 menit, demikian juga dengan lama waktu pemaparan 20 menit dan 30 menit, tidak menunjukkan perbedaan yang bermakna (p > 0,05).

Dikatakan oleh Supriatna dan Pasaribu (1992) bahwa perlu waktu yang cukup untuk pemaparan krioprotektan agar dapat tercapai keseimbangan kimiawi di dalam sel. Penelitian yang dilakukan,

memberikan hasil yang tidak berbeda antara 10, 20, dan 30 menit. Mungkin dapat dipilih lama waktu pemaparan 10 menit untuk mengawali proses vitrifikasi, karena dengan memperpendek lama waktu pemaparan oosit akan terhindar dari efek toksik dan waktu 10 menit cukup untuk memberikan kesempatan peresapan krioprotektan.

Tabel 3. Rata-rata Persentase (+ SD) Oosit Hidup Setelah Vitrifikasi dengan Krioprotektan EG+S; EG+S+BSA dan Lama Waktu Pemaparan yang Berbeda (10; 20; 30 Menit)

Krioprotektan

Lama Waktu Pemaparan (menit)

10

20

30

EG + S

EG + S + BSA

67,92 + 13,15

79,61 + 17,18

80,21 + 16,45

87,50 + 14,73

79,58 + 3,43

83,84 + 14,64

Bahwa persentase rasio oosit hidup akibat kombinasi macam krioprotektan dengan lama waktu pemaparan tidak berbeda nyata (p > 0,05). Hasil penelitian menunjukkan oosit tetap viabel. Diungkapkan oleh Nowshari et al. (1994) bahwa waktu pemaparan, konsentrasi krioprotektan, dan prosedur pencairan kembali mempengaruhi kemampuan fertilitas dari oosit dan perkembangan sampai pada tahap blastosis. Menurut Kasai (1996), kendala utama pada vitrifika si adalah toksisitas dari krioprotektan. Strategi untuk menghindari toksisitas media vitrifikasi adalah dengan memperpendek lama waktu pemaparan. Tetapi sebaliknya, apabila waktu pemaparan terlalu cepat, peresapan krioprotektan juga belum cukup, dan kris tal es intraseluler dapat terbentuk, sekalipun tidak ada kristal es ekstraseluler. Bagaimanapun juga, waktu pemaparan yang optimal demi suksesnya vitrifikasi harus dikompromikan antara menghindari kerusakan sel karena efek toksik krioprotektan dan menghin dari terbentuknya Kristal es intraseluler.

Krioprotektan Gliserol, DMSO, dan PROH

Persiapan Oosit

Koleksi dari ovarium sapi Holstein heifers atau sapi local kemudian ditransferkan dilab dengan 0,9 % cairan Na CL pada suhu 30-35 oC selama dua jam. Cumulus oocyte Complexes (COCs) diambil dari 3-5 antral folikel memakai needle ukuran 18 dan dicuci 4 kali dengan medium maturasi. Morfologi normal COCs dengan granulasi sitoplasma yang datar dan lapisan sel cumulus kompak yang diseleksi, kemudian 30-40 COCs ditransfer kedalam 4 multidish yang baik yang berisi 1 ml media matang dan dikultur selama 22-24 jam pada suhu 39oC dengan 5% CO2 di udara.

Protokol Kriopreservasi

Ini sulit untuk menegaskan bahwa kehadiran Badan Polar I Oosit yang dilampirkan dengan sel cumulus setelah maturasi. Namun demikian, kira-kira 90% (57/63) dari perkembangan oosit menuju stadium metaphase II pada 22-24 jam dari maturasi ketika mereka diperiksa setelah ditetapkan dan stained pada persiapan percobaan. Oleh karena itu, semua COCs ditempatkan secara langsung kedalam 2 ml PBS yang dilengkapi dengan 4mg/ml BSA, 60 µg/ ml penisilin G dan 100 µg/ ml streptomisin sulfat, yang mana 1,0 M gliserol, 1.0 DMSO atau 1.0 PROH ditambahkan. Kemudian, 20-30 COCs disetiap larutan dimuat kedalam 0,25 mL straw dan berimbang selama 30 menit pada suhu ruang. Straw memuat COCs yang kemudian ditabur dengan preecooled forceps dan dengan seketika dimasukkan kedalam freezer, dirawat pada suhu -51oC. Setelah memegang straw pada suhu tersebut selama 15 menit, itu semua didinginkan sampai -32,5 oC dan pada angka -0,5oC/ menit. Straw ditempatkan pada uap nitrogen cair selama 10 detik dan pada akhirnya dimasukkan kedalam nitrogen cair.

Setelah disimpan kedalam nitrogen cair selama 2-3 minggu, straw kemudian dithawing pada air selama 5 detik dan akhirnya dimasukkan kedalam water bath 37oC selama 30 detik. Setiap agen krioprotektif diubah dari cairan memakai tiga tahap proses cairan yang berisi krioprotektan dengan konsentrasi 0,7; 0,3 dan o M bersamaan dengan 0,25 M sukrosa. Setelah pembersihan krioprotektan, COCs dicuci 4 kali pada media mature dan dibebaskan dari sel cumulus dengan pipet yang diulang. Morfologinya tampak dari oosit frozen thawed yang kemudian dievaluasi dibawah stereomikroskop. Oosit dengan kegelapan, berganulasi, atau sitoplasma yang terfragmen, membrane vitelin yang tidak jelas, jarak perivitellin yang diperlebar atau zona pelucida yang retak, semua dipertimbangkan dari kerusakan morfologi.

Pemeriksaan Oosit Selama Penetrasi Spermatozoa

Pada 8 jam postinseminasi, oosit dibebaskan dari spermatozoa dan sejumlah oosit yang degenerasi dinilai. Oosit yang berkurang, terbagi-bagi dan atau sitoplasma yang pucat dipertimbangkan menjadi degenerasi. Beberapa oosit yang sisa diperbaiki dengan 25% acetic ethanol selama 5-7 hari. Oosit yang diwarnai dengan 1% orcein pada 45 % acetic acid dan diperiksa untuk keterangan dari penetrasi sperma dibawah mikroskop fase kontras. Oosit yang dipertimbangkan untuk penetrasi ketika nucleus sperma atau pronukleus jantan dan ekor sperma yang sesuai pada sitoplas disitoplasma.

Tabel. Normalitas dari cumulus dilampirkan untuk oosit sapi frozen-thawed dengan krioprotektan Gliserol, DMSO, dan PROH setelah dikultur untuk maturasi in vitro

Krioprotektan

Jumlah oosit yg difrozen

Jml (%)a dari oosit yg direcovered setelah thawing

Jml (%)b dari morfologi normal oosit

Gliserol

Dimetilsulfoxide

Prophylene glycol

173

207

180

163 (94)

108 (96)

167 (93)

101 (62)c

170 (86)d

138 (83)d

a persentase oosit yg difrozen

b persentase oosit yg recovered

cd perbedaan angka yg ditulis dengan satu kolom yg menandakan perbedaan yg signifikan (P<0.05).

Pada perlakuan selanjutnya menunjukkan bahwa 11-16 % dari oosit yang diinseminasikan dan degenerasi pada 8 jam postinseminasi dengan tidak ada signifikansi (P>0.05) berbeda diantara tiga krioprotektan tsb. Tipe krioprotektan yang baik (P>0.05) mempengaruhi jumlah oosit yang dipenetrasi. Tingginya proporsi oosit yang diinseminasikan yang penetrasi oleh spermatozoa setelah frozen-thawed dengan DMSO (79%) atau PROH (76%) daripada gliserol (59%). Tidak ada pengaruh yang signifikan ketika diobservasi pada proporsi dari oosit yang dipenetrasi dengan pronukleus dan dengan polispermia. Namun demikian, sebuah pembanding proporsi yg luas dari oosit frozen-thawed dengan PROH terbetuk keduanya pronukleus jantan dan betina setelah inseminasi in vitro.

Pencairan Kembali (Thawing). Pencairan kembali dilakukan dengan memasukkan ministraw ke dalam penangas air 30 oC. Oosit yang telah dikeluarkan dari ministraw dibilas 2 x dengan sukrosa 0,5 M (Sun et al., 1995).

Setelah disimpan kedalam nitrogen cair selama 2-3 minggu, straw kemudian dithawing pada air selama 5 detik dan akhirnya dimasukkan kedalam water bath 37oC selama 30 detik. Setiap agen krioprotektif diubah dari cairan memakai tiga tahap proses cairan yang berisi krioprotektan dengan konsentrasi 0,7; 0,3 dan o M bersamaan dengan 0,25 M sukrosa. Setelah pembersihan krioprotektan, COCs dicuci 4 kali pada media mature dan dibebaskan dari sel cumulus dengan pipet yang diulang. Morfologinya tampak dari oosit frozen thawed yang kemudian dievaluasi dibawah stereomikroskop. Oosit dengan kegelapan, berganulasi, atau sitoplasma yang terfragmen, membrane vitelin yang tidak jelas, jarak perivitellin yang diperlebar atau zona pelucida yang retak, semua dipertimbangkan dari kerusakan morfologi. (Rimayanti, 2001)

PEMBAHASAN

Evaluasi Oosit. Oosit diperiksa di bawah mikroskop inverted untuk diamati kualitasnya berdasarkan penilaian morfologis normal sebagai berikut: plasma membrane intak, ooplasma bergranulasi homogen, zona pelusida dan ooplasma berbatas jelas. Sedangkan morfologi oosit yang tidak normal menunjukkan bentuk yang tidak teratur dan terjadi degenerasi dengan ooplasma gelap dan berfragmentasi. Terhadap oosit ditambahkan bahan pewarnaan propidium iodide, kemudian preparat ini diinku basi dalam inkubator selama 30 menit. Gambaran yang terlihat di bawah mikroskop fluoresen adalah bila oosit hidup, ooplasmanya tidak akan menyerap warna (putih) dan bila oosit mati, ooplasmanya berwarna merah (Rimayanti, 2001)

Hasil dari studi yang dijelaskan sekarang ini menunjukkan bahwa dibawah protokol freezing memakai slow cooling dan 3 tahap thawing, PROH adalah krioprotektan yang efektif untuk mendorong kemampuan hidup dari beberapa oosit sapi. Walaupun sejumlah kecil dari oosit yang berkembang menuju stadium blastosist, data dati studi sekarang ini mengindikasikan bahwa perkembangan kemampuan dari frozen-thawed oosit sapi menuju stadium yang spesifik akan dinaikkan dengan seleksi dari krioprotektan yang tepat.

Kandungan biokimia dari PROH menjadikan sitoplasma yang tidak berbentuk selama kriopreservasi, meningkatkan permeabilitas membran, mempengaruhi depolimerasi dari filamen aktin. Pada perbedaan protokol slow freezing untuk oosit sapi, secara signifikan meningkatkan sejumlah kemampuan hidup oosit yang diperoleh dengan PROH atau etilen glikol. Pada manusia, disana tidak ada peningkatan pada aneuploid pada oosit yang matang atau kariotip abnormal pada stadium pronuklear embrio setelah kriopreservasi dengan PROH. Namun demikian, satu sisi dari krioprotektan itu sendiri, faktor seperti prosedur freezing, konsentrasi krioprotektan, suplemen pada cairan beku, stadium perkembangan oosit dan sumber oosit juga mempengaruhi efektivitas dari krioprotektan. Ini dilaporkan, bahwa dibawah protokol yang benar, PROH tidaklah efektif untuk freezing oosit tikus dan manusia, sejak insidensi yang besar dari aktivasi patogen yang ditemukan setelah freezing ketika konsentrasi tinggi dari PROH yang dipakai.

Gliserol telah luas dipakai untuk freezing embrio sapi karena sitotoksisitasnya yang rendah. Namun demikian, gliserol meningkatkan beberapa kerusakan osmotik untuk sitoplasma karena permeabilitas membran yang rendah. Hal tersebut telah diamati pada studi sekarang ini bahwa recovery dari initial shrinkage dari sitoplasma lebih rendah pada oosit yang diekspose dengan gliserol daripada dengan DMSO atau PROH selama proses penyeimbangan dengan krioprotektan. Martino et al menjelaskan bahwa cairan stress yang dihasilkan oleh krioprotektan mengganggu efek ketahanan oosit sapi yang matang setelah kriopreservasi. Temuan kita bahwa oosit sapi yang matang frozen-thawed dengan gliserol memiliki morfologi yang tidak baik dan perkembangan kemampuan yang rendah dalam mendorong hipotesis ini.

Dibandingkan dengan gliserol, keduanya DMSO dan PROH merawat lebih tinggi integritas morfologi dari oosit yang dengan seketika setelah thawing dan penetrasi sperma lebih tinggi pada 8 jam postinseminasi. Namun demikian, proporsi oosit mengembangkan menjadi stadium 8 sel yang secara signifikan menurun dari frozen dengan DMSO daripada PROH. Hal ini dilaporkan bahwa DMSO memiliki toksisitas yang spesifik pada system sitoskeletal dan jalur glikolisis. Hal ini juga dilaporkan bahwa oosit sapi yang matang sangat sensitive pada krioprotektan dan bahwa kurang dari 10 % dari metaphase 2 kumparannya memiliki bentuk yang normal setelah pembukaan pada krioprotektan selama satu menit. Namun demikian, data sekarang mengindikasikan bahwa DMSO tidak rusak terhadap respon mikroorganisme untuk morfologi dan penetrasi sperma. Cukup, toksisitas dari DMSO utamanya mempengaruhi perkembangan oosit pada stadium 8 sel.

KESIMPULAN

Pada kesimpulannya, Etilen Glikol dan PROH dapat dipakai untuk kriopreservasi oosit sapi yang mature untuk memelihara kemampuannya untuk berkembang menuju stadium 8 sel setelah thawing dan IVF, dibandingkan dengan gliserol dan DMSO. Namun demikian, pada studi sekarang ini, kita memakai protokol yang sama untuk menyeimbangkan dan mengganti 3 krioprotektan yang berbeda, dan karakteristik permeabilitas yang berbeda dari krioprotektan ini tidak dapat diperkirakan. Untuk mendirikan metode yang pantas dalam menyimpan oosit sapi, penelitian lebih lanjut, yangmana dapat diatur untuk mengetahui pengaruh keseimbangan dan waktu dari penggantian krioprotektan pada ketahanannya dan mengembangkan kapasitas oosit setelah freezing dan thawing dengan setiap krioprotektan sangat dibutuhkan.

DAFTAR PUSTAKA

Anonim. Applied Animal Reproduction

Arthur, H, dkk. 2001. Arthur’s Veterinary Reproduction and Obstetrics 5th Edition. London

Begin, Isabelle. dkk. 2002. Cryopreservation of Goat Oocytes and In Vivo Derived 2 to 4 cell Embryos Using The Cryoloop (CLV) and Solid Surface Vitrification (SSV) Methods. Hungarian Academy of Sciences: Hungaria

Eroglu, Ali. 2009. Cryopreservation of mammalian oocytes by using sugars: Intra- and extracellular raffinose with small amounts of dimethylsulfoxide yields high cryosurvival, fertilization, and development rates. Dept Obstetrics and Ginecology: Georgia

Hafez , B dan Hafez, E.S.E, editor. 2000. Reproduction Farm Animals 7th Edition. Lea and Febiger; p. 419-424: Philadelphia

Ledda, S. dkk. 2000. Oocyte Cryopreservation and Ovarian Tissue Banking. Dept Surgery and Obstetrics Veterinary, University of Sassary: Italy

Lim, JM, dkk. 1999. Development of In Vitro Matured Bovine Oocytes After Cryopreservation With Different Cryoprotectants. College of Veterinary Medicine: Seoul

Rimayanti, 2001. Pengaruh Proses Vitrifikasi Dengan Krioprotektan Etilen Glikol Terhadap Daya Hidup Oosit Sapi. Dept Reproduksi dan Kebidanan Unair: Surabaya.

Sun, Q.Y., Q.Z. Yang, G.Y. Liu, H.L. Feng, and P.C. Qin. 1995. Cryopreservations of Bovine Oocytes Matured In Vitro. Theriogenology 42 : 329.

Tervit, HR. dkk. 2005. Successful cryopreservation of Pacific oyster (Crassostrea gigas) oocytes. Cawth Ron Institute: New Zealand


Tidak ada komentar:

Poskan Komentar